Способ идентификации генотипов сорго Советский патент 1990 года по МПК A01H1/06 G01N33/68 

. Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к селек- ции и семеноводству, и может быть использовано научными учреждениями при создании и паспортизации линий, сортов и гибридов сорго.

Целью изобретения является увеличение точности анализа.

Способ состоит в том, что экстракция кафирина проводится после удаления из муки зерна сорго танинов (полифенолов) дистиллированной водой, изопропанолом или этим растворителем, содержащим мочевину при нагревании, электрофорез или изоэлек- трофокусирование белков осуществляется в пластинчатом полиакриламидном геле с последующим проявлением кафириновых компонентов трихлоруксусной кислотой и окраской кумасси R-250, определением относительной мобильности каждого из компонентов, составлением белковых (кафириновых) формул линий: сортов, гибридов сорго.

П р и м е р 1. Зерна сорго размалывают до тонкого порошка, отвешивают 600 мг, заливают 45 мл холодной дистиллированной водой и выдерживают при 4°С в течение 30 мин. Центрифугируют при 8000 g в течение 15 мин, воду сливают, а осадок заливают 2 мл 70%-ного изопропанола, перемешива- помещают в водяную баню на 1 ч при 60 С. После центрифугированиия при 8000 g в течение 15 мин супернатант упаривают досуха под феном и растворяют в 100 мкл 8 М мочевины, содержащей 20% сахарозы, 5% 2-меркаптоэтанола и 0,6% уксусной кислоты. Раствор белка нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин и наносят в карман геля 40 - 50 мкл.

Электрофорез проводят в пластинчатом геле размером 110x110x1 мм, содержащем, %: акриламид 10; метиленбисакриламид 0,2; уксусная кислота 2; ТЕМЕД 0,3: глицин 0,1,- мочевина 8 М; аскорбиновая кислота 0,05; сернокислое закисное железо 0,001; персульфат аммония 0,025. Электродный буфер содержит 0,4% уксусной кислоты и 0,04% глиимна. Электрофорез ведут 30 мин при напряжении 250 В, а затем 3,5 ч при напряжении 500 В. После окончания электрофореза гели фиксируюг в течение 30 мин в 10%-ном растворе трихлорухсусной кис

Os

hO XI CJ

лоты, а затем окрашивают 0,001 %-ным раствором кумасси R-250 в течение 1,5 - 2,0 ч при постоянном перемешивании.

За репер принимают наиболее интенсивный компонент в средней части геля (Bso) и путем измерения расстояния от старта до положения каждого белкового компонента вычисляют подвижность (ОЭП). Компоненты группируют по подвижности: А - субфракция от О до 41, В - субфракция от 42 до 54, С - субфракция от 55 до 65 и D - субфракция от 66 до 100, и составляют белковые (кафири- новые) формулы для каждого генотипа (по данным электрофореза), приведенные в табл.1.

П р и м е р 2. Зерна сорго размалывают до тонкого порошка, отвешивают 200 мг мут ки, заливают 15 мл холодной дистиллированной воды и оставляют при 4°С на 30 мин, центрифугируют при 8000 g в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а к осадку добавляют 2 мл 70%-ного изопропанола, содержащего 4 М мочевины, перемешивают и оставляют стоять на 30 мин при комнатной температуре, затем 1 ч - при 60°С на водяной бане. Проводят центрифугирование взвеси при 8000 g 15 мин. Надосадочную жидкость сливают, упаривают под феном до 1 /8 - 1 /10 первоначального объема и наносят на гель для изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в объеме 30 - 35 мкл на дорожку. На одну из дорожек наносят смесь белков - маркеров с известными ИЭТ. ИЭФ проводят в пластинках геля размером 240x110x0,5 мм, содержащего, %: акриламид 5; метиленбисакриламид 0,27; ТЕМЕД 0,045; персульфат аммония 0,36; амфолит - носитель с интервалом рН 4 - 92; мочевина 7 М при 12°С. Режим ИЭФ: 15 мин 200 В, 15 мин 400 В, 15 мин 800 В, 45 мин 2400 В. После окончания ИЭФ гели фиксируют в 10%7ном растворе ТХУ, содержащем 3,5% сульфосалициловой кислоты, в течение 30 мин, промывают 30 мин 10%- ным раствором ТХУ и окрашивают при постоянном перемешивании 0,001 %-ным кумаси R-250.

ИЭТ разделившихся компонентов находят по калибровочной кривой, построенной с учетом положений белков-маркеров с известными ИЭТ. Компоненты кафирина группируют в соответствии с их ИЭТ: а-субфракция от 3,5 до 6,5; -субфракция от 6,6 до 8,0; у-субфракция от 8,1 до 9,5, и составляют специфические белковые (кафи- риновые) формулы для каждого генотипа

(по данным ИЭФ), приведенные в табл.2.

Белковая (кафириновая) формула характеризует каждую линию, сорт или гибрид сорго. На ее основе паспортные данные (цифровые) образца можно хранить в памятиЭВМ.

Предлагаемый способ идентификации генотипов сорго отличается объективностью, надежностью, быстротой при распознавании сортов, линий, гибридов сорго. Белковые формулы можно хранить в памяти ЭВМ,

Формул а изобретения

1. Способ идеАтификации генотипов

сорго, включающий экстракцию пролами- нов из размолотых зерен, их разделение в электрическом поле и анализ полученных белковых спектров, отличающийся тем, что, с целью увеличения точности анализа, кафирин экстрагируют после удаления дистиллированной водой танинов изопро- панолом при нагревании с дальнейшим вос- становлёнием дисульфидных связей, белковые спектры анализируют путем определения электрофоретической подвижности каждого компонента и группировки их в соответствии с их мобильностью относительно реперного компонента Bso с дальнейшим составлением белковых формул.

2. Способ по п. 1,отличающийся тем, что при изоэлектрофокусировании экстракцию кафирина производят изопропа- нолом, содержащим мочевину, без восстановления дисульфидных связей, при

этом белковый спектр анализируют путем определения изоэлектрических точек компонентов по маркерным белкам.

(D

д- s с; ID D

см

as

3s с: ю та

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в селекционно-генетических исследованиях. Целью изобретения является повышение точности анализа. Способ состоит в том, что кафирин экстрагируют изопропанолом после удаления дистиллированной водой танинов, проводят разделение в электрическом поле, после чего составляют белковые формулы, сопоставляя белковые спектры относительно реперного компонента В₅₀. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.