Способ получения гибридных культур грибов Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения гибридных культур грибов, юоторый может быть использован при получении новых штаммов грибов с заранее заданными свойствами п микробиологической, в медицинской промышленности. и сельском хозяйстве.

Цель изобретения - повышение выхода и стабильности гибридных культур грибов.

Способ состоит в том, что перед слиянием протопласты одного из родительских штаммов обрабатывают стероидным гликозидом дельтонином в кон- иентрации 0,02% в течение 5-10 мин. При концентрации ниже 0,01% эффективность слияния уменьшается, т.е. снижаемся выход гибридных культур, а при концентрации выше 0,02% падает стабильность протопластов. При меньшем времени обработки снижается эффективность слиянии, большее время

обработки уменьшает стабильность протопластов.

Способ осуществляют следующим

образом.

Протопласты грибов получают с помощью литической смеси ферментов. К суспензии протопластов одного из штаммов добавляют дельтонин до концентрации 0,01-0,02%, выдерживают 5-10 мин при комнатной температуре. Слияние протопластов осуществляют в буферном растворе, содержащем по- лиэтиленгликоль и стабилизирующие вещества, Через определенные промежут- ки времени под микроскопом отбирают гибридные культуры и помещают на селективную среду выращивания. Полученные гибриды стабильны и при культивировании не распадаются на родительские клетки.

Пример 1. Культура гриба Trichoderma reesei QM94I4, хранят на картофельно-дестрозном агаре.

(Л

сп

4 4ь

J

СО СО

Инокупят готовят на диститлироначноп поде. Вмращнванис ведут в копбах )р- ленмеиера при перемешивании н-1 среде Гаги при Ю°С. ИОС.ЛР 20-часового роста мицелии отделяют гЪипь грованием, дважды промывают дистилпированной водой, татем О, OS М Фосфатным fiyrtie- ром с рН 6, 5, содержащим 0,7 М 1 П4 1 (осмотический стабилизатор) г стреп- омиппнсулыЬпт в концентрации 50 мкг/мл (буфер /О. 100 мг промытоо мицепия (по сырому носу суспенируют в 4 мл Gytbepa Л, содержа:цего акже SO мг птирующеи смеси, состояей из технических ферментных препаратов целловиридина и пектофоедина, взятых в соотношении 1:1. Послте 4- часовой инкубации полученные прото- штасты ОТДРПЯЮТ от неразрушенных клеток Фильтрованием через стекчнн- ный фильтр, промыв тот несколько раз буфером А. и концентрируют фильтрат центрифугированием при 1 ОООг; в течение 5 мич.

Таким же образом получают протопласты из 40-часового мицелия грибов Fhanerr.ohaet e chryrosrrriuni . К концентрированной суспензии протопластов Tri ir-od rr.a добавпяюг дельтонин п,о концентрации 0,01%, выдерживают 5 мин, центрифугируют при 1000 об./мип. Концентрированную суспензию протоппастов разводят 0,05 М трис-НП. буферным раствором с pi 8,0, содержащим 0,02 К Ст.01 г и 0,7 М ГЛуЛ , до концентрации протопластов 10 мл. К 3 мл полученной суспензии добавляют 250 мкг стрептомицинсупьфата, 25/1 политтиленгликоня и 0,2 мл суспензии протоппастов Tr i (до конечной концентрации 10 протопластов в мл). Систему инкубируют при 30°С, наблюдая под микроскопом за процессом слияния протопластов. Полученные фузанты (продукты слияния) отбирают под микроскопом и высевают на картофельно-декстрозную среду. Через

0

5

0

5

0

5

0

5

несколько дней кочонии, морфологически о пшчающирся от родитепьоких штаммов, высевают и последовательным разбавлением получают моноклетку. На ос- ЦОВР моноклетки высевают колонию. Полученная гибридная культура является стабильной (хранится более года) и жизнеспособной. Глубинное культивирование ведут на средах Мандельса, Кирка.

Исследование морфологии гибридных клеток свидетельствует об осуществлении межродового слияния мице- лиальных грибов двух классов - дейте- ромицетов и базидиамицетов. Новая культура продуцирует ферментный комп- ЧРКС, проявляющий лигнолитическую (как Phanerochaete chrysosporium) .и цгллюлолитическую (как Trichoderma ) активности. По сравнению с р дительскими штаммами повышается активность целлобиазы.

11 р и м е р 2. Способ осуществляют ci.гласно примеру 1 , но в качестве родительских штаммов используют Trir-hcdf-rma lon ihrachiat im , Pleiaro- tu: i trrqtu 0482. Дельтонином в концентрации 0,02% обрабатывают протопласты Trichoderma longibrachia- tiim 726 в течение 10 мин Получают стабильные жизнеспособные фуэанты.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать стабильные гибридные культуры грибов, принадлежащих различным родам. Формула изобретен « я

Способ получения гибридных культур грибов, включающий слияние протопластов в буферном растворе, содержащем политтиленгликоль и стабилизирующие вещества, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и стабильности гибридных культур, перед слиянием протопласты одной из родительских форм обрабатывают дель- тонином в концентрации 0,01-0,02% в течение 5-10 мин.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к слиянию протопластов, и может быть использовано в медицине и сельском хозяйстве. Целью изобретения является повышение выхода и стабильности гибридных культур грибов. Способ состоит в том, что протопласты одного из родительских штаммов перед слиянием обрабатывают дельтонином в концентрации 0,01-0,02% в течение 5-10 мин.