Штамм гриба @ @ ВКПМ @ -326 - продуцент лимонной кислоты Советский патент 1987 года по МПК C12N1/14 C12P7/48 C12N1/14 C12R1/685 

11

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба вида Aspergillus niger, продуцирующего лимонную кислоту в условиях глубинного культивирования .

Целью изобретения является получение нового штамма, обладающего высокой продуцирующей активностью по образованию лимонной кислоты при ферментации на мелассных растворах.

Новый штамм получен в результате селекции с использованием метода генной инженерии: гибридизации путем слияния протопластов, полученных из мицелия двух штаммов Aspergillus niger штамма Л-106, культивируемого в производстве лимонной кислоты поверхностным способом, и штамма Л-4. В результате гибридизации выделен реком- бинатный штамм 91-2 с новыми свойствами, объединяющий в себе генотипы двух промышленных штаммов, дающих потомство, совмещающее свойства родительских штаммов.

Протопласты получают из 17-часового мицелия, выращенного на минимальной синтетической среде, содержащей, г/л:

Глюкоза 3,0 Дигидроорто- фосфат калия 0,5 Сульфат магния, .гидрат0,5

Сульфат аммония0,5 Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД)0,5 Пептон2,5 Вода Остальное

В качестве литического фермента применяют смесь дрожжелитина Г10Х и лиофилизированного пищеварительного сока виноградной, улитки (ПСУ) в 0 мМ фосфат-цитратном буфере. Стабилизатором протопластов служит 0,6 М КС1. Слияние- протопластов осуществляют в 30%-ном растворе полиэтиленгли- коля, содержащем 0,01 М регенерацию слившихся протопластов - на плотной гипертонической минимальной среде. Из 100 отобранных рекомбинатон один - 91-2 синтезирует наибольшее количество лимонной кислоты с высоким выходом от сахара. Для закрепления новых свойств конидии выделенного ре- комбината обрабатьгоают 0.,01%-ным вод

22

ным раствором 1 ,,4-бис-диазоацетилбу- тана (ДАВ) в течение суток при +4°С. Из 100 полученных мутантов после изучения их кислотообразующей способнос- ти отбирают мутант 91-2-79 - штамм Л-5 (Ленинградский-5), имеющий номер ВКПМ F-326.

Новый штамм обильно образует конидии золотисто-желтого цв ета, являющиеся посевным материалом в производстве лимонной кислоты. В 7%-ном по сахару сусле конидии начинают прорастать через 6ч.

Штамм является более устойчивым

к бактериальной флоре (Е. coli, B.me- sentericus. С, tropicalis и др.), сопутствующей производству лимонной кислоты, по сравнению с производственными штаммами Л-1 и Л-4.

Штамм ВКПМ F-326 является активным продуцентом лимонной кислоты при глубинном культивировании как в условиях технологии разбавленных, так и по техйологии концентрированных сред.

При культивировании в глубинных ; условиях на разбавленных меласных средах штамм образует на 8,6% больше лимонной кислоты с 1 М в сутки. Одновременно снижается удельный расход мелассы на 11,5% по сравнению с производственным штаммом Л-1.

Морфолого-культурапьные признаки. Диаметр колонии, конидиальных головок, длина конидиеносцев, диаметр

конидий у нового штамма приближаются к размерам тех же величин родительского штамма Л-106. Длина стеригм I и II порядков у штамма близка к другому родительскому штамму - Л-4.

Новый штамм имеет мелкие пузырьки на конидиеносцах.

Штамм Aspergillus niger ВКПМ F-326 на суслоагаре образует крупную колонию, достигающую на 5-е сутки в диаметре в среднем 8,1 см. Окраска колонии золотисто-желтая. Воздушный мицелий хорошо развит, конидиеношение обильное, В центре конидиальные головки расположены плотно, несколько

возвьш1аются над остальными. От центра к краю колонии конидиальные головки мельче. По краю колонии в радиусе 0,4 см светлая аконидиальная зона. Обратная сторона колонии гладкая

белая.

На 5-е сутки на среде Чапезса вырастает колония диаметром 5,7 см. Окраска колонии золотисто-желтая.

313

в центре колонии конидиальные головки крупные, расположены несколько плотнее, чем по остальному газону роста. К краю колонии величина кони- диальных голавок уменьшается, нарастающий край в радиусе 0,4 ем покрывают незрелые мелкие конидиальные головки. Обратная сторона колонии гладкая, белая.

Признаки нового шт.амма представлены в табл. I . .

Морфологические свойства у пяти- суточных культур, выращенных при на суслоагаре, следующие: конидиальные головки круглой формы, диаметр их сечения 74-169 мкм, средний диаметр головок 119 мкм. Вздутие ко- нидиеносца (пузырь) шаровидной формы диаметром от 22x20 до 62x80 мкм, средний диаметр 36x34 мкм. Стеригмы двуслойные, длина стеригм первого порядка 5,3-25,3 мкм, в среднем 14,8. Стеригмы второго порядка длиной 4,Ох х9,3 мкм, в среднем 6,0 мкм. Конидии круглые с толстой желтой оболочкой. Средний диаметр конидий 3,75 мкм. Конидиеносды прямые, бесцветные,длина конидиеносцев 400-2000 мкм, ширина 8-25 мкм.

Образование лимонной кислоты у нового штамма изучено при различных режимах ведения процесса:

в лабораторных опытах в глубинных условиях выращивания на мелассных средах с содержанием сахара 30 г/л (табл. 2);

в лабораторных опытах в глубинных условиях на мелассных средах с содержанием сахара 130 г/л (табл. 3);

в производственных циклах в цехе глубинной ферментации по производству лимонной кислоты на мелассных средах с исходной концентрацией сахара 30 г/л по технологии ферментации отъемно-доливным способом (табл. 4).

Результаты испытаний предлагаемого штамма по сравнению с известными 1-1 и Л-4 предста влены в табл. 2-4.

Из таблиц следует, что штамм Л-5 является более активным кислотообра- зователем при всех испытанных режимах по сравнению с производственными штаммами.

Пример 1. Процесс ферментации осуществляют в глубинных условиях на качалке типа АВУ-50 р с числом

5

54724

качаний 160 в мин в колбах емкостью 700 см при .

Опыты проводят на образце мелассы, имеющей следующую характеристику: 5 сахароза 46%, СаО 1,31%, рН 6,3.

Для подращивания мицелия готовят мелассньй раствор, содержащий 30 г/л сахара. Состав среды для подращивания , г /л: 0 Меласса 65,1

Карбонат натрия 0,087

Гексацианоферроат калия, гидрат 0,261

Оксалат аммония, гидрат (для полного осаждения

СаО)2,16

Дигидроортофосфат калия 0,16 0 Сульфат магния,

гидрат0,25

Сульфа;т цинка,

гидрат0,005

рН6,8-7,2

ВодаДо 1 л

Для ферментации готовят мелассную среду, содержащую 30 г/л сахара (указанная среда для подращивания мицелия), но без добавления сульфата маг- ния. Состав среды для подлива следующий, г/л:

Меласса 543,4

Гексацианоферроат калия, 5 гидрат2,355

ВодаДо 1 л

Для приготовления споровой суспензии 0,1 г спор Aspergillus nlger замачивают в 10 мл мелассного раствора, 0 приготовленного для подращивания мицелия, в течение 1 ч при . Приготовленный для ферментации мелассный раствор разливают в колбы по 50 мл и засевают 10 мл споровой суспензии. В этой среде споры подращивают 24 ч. Подрощениый мицелий посевньм материалом для засева ферментируемой среды.

0 Среду, приготовленную для ферментации, разливают в колбы по 50 мл и вносят в них по 10 мл подрощенного мицелия.

В процессе ферментации проводят

5 подливы мелассного раствора, содержащего 250 г/л сахара, по следующей схеме: первый подлив через 24 ч ферментации в количестве 10 мл, второй подлив через 30 ч ферментации в количестве 9 мл, а затем по А мл чере 5, 6 и 7-е сутки ферментации. Проце ведут 9 сут.

В качестве контроля используют производственные штаммы Л-4 и Л-1. Результаты испытаний, представленны в табл. 2, показывают, что у селекционированного штамма возрастает массовая доля лимонной кислоть в составе синтезируемых кислот.

Съем лимонной кислоты у нового штамма возрастает на 11,8% по сравнению со штаммом Л-1 и на 6,3% по сравнению со штаммом Л-4.

У нового штамма соответственно увеличивается выход лимонной кислот от сахара на 11,9% по сравнению со штаммом Л-1 и на 6,4% по сравнению со штаммом Л-4.

Пример 2. Условия проведения те же, что и в примере 1. Подращивание мицелия проводят иа мелас сных средах, содержащих 50 г/л сахара; на ферментацию используют мелас сные среды с содержанием сахара 130 г/л.

Для подращивания используют мела сную среду, содержащую, г/л:

Меласса 109

Карбонат натрия0,145

Гексацианоферроат калия, гидрат 0,436

Оксалат аммония,

гидрат (для полного осаждения

СаО)3,63

Сульфат магния,

гидрат0,25

Дигидроортофосфат калия 0,16

Сульфат цинка,

гидрат 0,005

рН6,8

ВодаДо 1 л

Для ферментации используют мелас сную среду, содержащую, г/л: Меласса 283 Карбонат натрия 0,38 Гексацианоферро- ат калия, гидрат 1,128 Оксалат аммония, гидрат (для выведения 1/2 солей кальция в пересчете на СаО)4,7

Дигидроортофосфат калия0,16

5

0

5

Сульфат цинка, гидрат0,005

рН6,0

ВодаДо 1 л

Для приготовления споровой суспензии 0,1 г спор Aspergillus niger замачивают в 10 мл мелассного раствора, содержащего 50 г/л сахара и приготовленного по прописи для подращивания мицелия, в течение 1 ч при 32 С. Приготовленный мелассный раствор для подращивания, содержащий 50 г/л сахара, разливают в колбы по 50 мл и засевают 10 мл споровой суспензии. В зтой среде споры выращивают 24 ч. Подрощенный мицелий служит посевным материалом для засева ферментационной среды.

Ферментационную среду с содержанием сахара 130 г/л разливают в колбы по 50 мл и вносят в них по 10 мл подрощенного мицелия. Весь процесс ферментации протекает на исходном растворе без дополнительных дробных доливов питательной среды и заканчивается через 5 сут (табл. 3).

Контролем служат варианты опытов, в которых процесс ферментации осуще0 ;ствляют в тех же условиях, но возбудителями процесса являются производ- ственные штаммы Л-1 и Л-4 (табл. 3).

Испытания показали, что на концентрированных мелассных средах с содержанием -сахара 130 г/л полученный щтамм увеличивает съем лимонной кислоты на 12,% по сравнению со штаммом Л-1 и на 7,9% по сравнению со штаммом Л-4. Кроме того, селекциони0 рованный штамм увеличивает выход лимонной кислоты от сахара на 12,1% по сравнению со штаммом Л-1 и на 7,7% по сравнению со штаммом Л-4, культивируемыми в тех же условиях.

Пример 3. Выращивание кислотообразующего мицелия нового штамма и синтез лимонной кислоты осуществляют глубинным способом на разбавленной по сахару мелассной среде в

0 производственных условиях.

На замачивание конидий, подращивание посевного материала, ферментацию и доливы используют мелассный раствор, приготовленный из одной и

5 той же мелассы с отработанным для нее режимом приготовления сред.

При ведении процесса t использованием штамма ВКПМ F-326 на разбавленной среде подращивание осуществля5

5

меласют в 5 м -ферментаторах с 3 м сной среды с содержанием сахара 30 г/л. Через 24 ч подрощенный мицелий в объеме 3м переводят в ферментатор, содержащий 27 м мелассного раствора с концентрацией сахара 30 г/л. Через 24 ч ферментации начинают подлив мелассного раствора, содержащего 180 г/л сахара, по I м через каждые 1,5 ч.

На 5-е сутки ферментации проводят отъем ферментированного раствора в количестве 5 м . После отъема в ферментатор вводят 5 м мелассного раст вора, содержащего 180 г/л сахара .

Процесс ферментации заканчивается через 7 сут, в контрольном опыте - 8 сут. В качестве продуцента в контрольном цикле, проведенном по тому же режиму ферментации, используют производственный штамм Л-1.При таком ведении процесса у нового штамма массовая доля лимонной кислоты в сумме синтезируемых кислот в среднем из четьфех опытрв составляет 86,73%. Съем лимонной кислоты с 1 м в сутки

Втакм

Окраска коккдий

Л- (из- Бежевая87132 50x50 330-1320 П-20 10,4 6,3 4,1

.вестиый)

Л-5 Зблотнс-57119 33x35 400-2000 12,4 14,8 6,0 3,75

(ВКПМ F-326) то-желтая

9,55

, 9.55

9,55

9,0 6,13 93,4 б.б О

9,0 5,53 92,7 7,34 О 9,0 5,85 92,2 7,8 О

8

0

5

0

9,9 кг, удельный расход 46%-ной мелассы на 1 т лимонной кислоты - 2466 кг, выход лимонной кислоты от сахара - 88,16% (табл. 3). У производственного штамма Л-1 массовая до- ля лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот составляет 86,14%, съем лимонной кислоты с 1 м в сутки - 8,64 кг, удельный расход 46%- ной мелассы на 1 т лимонной кислоты - 2697 кг, выход лимонной кислоты от сахара - 80,6% (табл. 3).

Таким образом, новый штамм в условиях производства образует на 11,5% больше лимонной кислоты с 1 м в сутки и дает экономию мелассы на 8,6% по сравнению с производственным штаммом Л-. Кроме того, штамм за менее продолжительный (7 сут) цикл быстрее, чем штамм Л-1 накапливает то же количество лимонной кислоты.

Формула изо.бретения

Штамм гриба Aspergillus niger

ВКПМ F-326 - продуцент лимонной кислоты.

Таблица I

5.72 10,6 И1,в 6й И1,9 I06,i

5,12 9,48 100 53,6 100 - 5,39 10,0 105,5 56,4 - 100

7.0

7,0

7,0

5,0 4,27 93.0 7,0 О 5,03,84 92,0 8,0 О

5,04,05 91,0 О

Л-1

Л-5

-(ВКПМ Г-326)

7,98 86,14 3,12 10,74 3700 8,64 100,0 2697 100 80,6 7 86,73 7,23 6,04 3717 9,9 1И,5 2466 91,4 38,2

Составитель 3. ФаЛуиина Редактор Н. Егорова Техред А.КравчукКорректор т. Колб

Заказ 2316/26 .Тираж 499Подписное

ВНИШШ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

т а б л и ц а 3

3,972 13,24 112,5 56,7 112,1 107,7 3,53 11,77 100,0 50,4 100,0

3,69 12,30 104,6 52,7 -100,0

Таблица 4

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма гриба, используемого для производства лимонной кислоты в условиях глубинного культивирования . Селекционированный штамм As- pergillus niger ВКПМ F-326 обладает высокой активностью образования лимонной кислоты при глубинном культивировании на разбавленных и концентрированных мелассных средах, образуя до 9,9 кг/м в 1 сут лимонной кислоты. При этом выход от редуцирующих веществ составляет 88,2%. 4 табл. g (Л