СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PTIVY4, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ И ШТАММ БАКТЕРИЙ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ РАСТЕНИЙ Советский патент 1994 года по МПК C12N15/84 C12N1/21 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии высших растений, и может быть использовано в прикладных целях для получения исходного материала растений для селекции классическими методами, а также в различных биотехнологических задачах, например, для ускорения укоренения при получении незараженного безвирусного и т. д. ) посадочного материала или при микpоклональном размножении растений.

Целью изобретения является ускоренное укоренение трансгенных растений при черенковании.

Растения инфицируют штаммом Agrobacterium tumefaciens ВКПМ В-4428 переносчиком (xyl-гена) гена глюкозоизомеразы, переносят селективную среду, содержащую для индукции побегообразования бензиламинопурил (БАП) отбирают растения, укоренившиеся в присутствии антибиотиков, из них растения с неомицинфосфотрансферазной активностью (NPT 11), а из последних с помощью блоттинг-гибридизации отбирают линии, в которых присутствует xyl-ген и проверяют в них экспрессию xyl-гена с помощью цистеинкарбозольного теста.

Сконструирована плазмида pTiVY4 и получен штамм Agrobacterium tumefaciens С581 (pTiVY4).

Описание плазмиды pTiVY4.

Предназначена для переноса в растения гена глюкозоизомеразы E. coli и экспрессии xyl-гена в растениях; состоит из плазмиды агробактерий pGV 3850 neo размером около 200 т. п. н. обеспечивающей перенос в растения гена устойчивости к канамицину и любого сцепленного с ним гена и включенной в нее путем гомологичной рекомбинации in vivo "промежуточной" векторной плазмиды pVY4, состоящей из репликона pBR 322, бактериальных маркеров устойчивости к ампициллину (Ap^R), карбенициллину (Cb^R) и канамицину (Km^R), нопалинсинтазного промотора и клонированного под контролем nos-промотора фрагмента ДНК и E. coli размером 2,2 т. п. н. , содержащего xyl-ген; плазмида конъюгативна и может быть перенесена в любой другой штамм агробактерий, не содержащий плазмид той же группы несовместимости.

Описание штамма. Штамм Agrobacterium tumefaciens C58Cl (pTiVY4) по способу культивирования и морфологии не отличается от любых штаммов A. tumefaciens, в том числе от штамма дикого типа A. tumefaciens C58(pTiC58) и от прототипа - штамма A. tumefaciens C58Cl (pGV 3850 neo).

Штамм может осуществлять генетическую трансформацию чувствительных растений - перенос гена устойчивости к канамицину без нарушения морфологии и фертильности трансформированных растений. Основное отличие состоит в том, что заявляемый штамм содержит модифицированную Ti-плазмиду, что обеспечивает перенос в растения вместе с геном NRT 11 также xyl-гена.

Штамм A. tumefaciens C58Cl растет на УЕВ стандартной среде (на 1 л H₂О): 5 г сахарозы, 5 г пептона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 10^-2 Mg⁷⁺ и 15 г агар-агара, pH 7,2).

Клетки - короткие подвижные грамотрицательные палочки размером (0,6-1,0) (1-3) мкм на агаризованной среде образуют серо-коричневые круглые слизистые непрозрачные колонии. В жидкой среде образуют звездочки коагулянтов.

Используемые материалы и методические приемы.

Бактериальные штаммы и плазмиды: "промежуточный вектор" для переноса генов в растения под контролем нопалинсинтазного промотора (nos) - плазмида pZGV 2382; штамм A. tumefaciens C58Cl, несущий "обезоруженную" векторную Ti-плазмиду pGV 3850 neo, способный осуществлять перенос в растения маркерного гена устойчивости к канамицину (Km^R), а также любого другого гена, который может быть интегрирован в T-область этой плазмиды и сцеплен с геном Km^R; методы трансформации растений с помощью векторной системы плазмид агробактерий, селекции устойчивых к канамицину трансгенных растений, тестирования активностифермента неомицинфосфатрансферазы 11. отвечающей за признак Km^R (NPTII-тест), все прочие методы генной инженерии, обработка ДНК рестриктазами и другими ферментами, используемыми в генетической инженерии, проводилась в условиях, рекомендованных поставщиками ферментов.

П р и м е р 1. Поскольку непосредственное клонирование xyl-гена в векторную плазмиду агробактерий pGV 3850 из-за ее большого размера (около 200 т. п. н. ) технически неосуществимо, используют прием клонирования гена в "промежуточную" векторную плазмиду pZGV 2382. (BamHl - HindIII) - фрагмент ДНК, содержащий xyl-ген, препаративно элюируют из агарозного геля и смешивают в соотношении 5: 1 с ДНК pZGV 2382, предварительно рестрицированной по BamHI и E. coRI сайтами, смесь легируют и трансформируют в штамм E. coli K802. Отбирают Ap^R, Km^R - клоны и анализируют плазмидную ДНК с помощью рестрикции и электрофореза. Плазмиды, соответствующие ожидаемой рестрикционной карте, трансформируют в штамм E. coli, xyl^-, где их xyl⁺ -фенотип подтверждают по росту на минимальной среде с ксилозой в качестве единственного сахара. Полученную плазмиду обозначают.

Смешивают равные количества ночных культур донора E. coli (pVY4), помощника E. coli HB101 (pR K2013) и реципиента A. tumefaciens C58Cl (pGV 3850 neo), собирают на нитроцеллюлозном фильтре и инкубируют на поверхности стандартной агаризованной LB-среды в течение ночи, смывают и высевают на селективную среду. В качестве селективной среды используют минимальную солевую среду B (селекция против E. coli, т. к. используемые штаммы ауксотрофы, а A. tumefaciens прототроф), содержащую антибиотики: Cb - 100 мкг/мл (маркер плазмиды pGV 3850 neo), рифампицин - 50 мкг/мл (маркер штамма A. tumefaciens), канамицин - 50 мкг/мл (маркер на плазмиду pZGV 2382, т. к. эта плазмида содержит бактериальный ген Km^R из Tn⁵, дающий устойчивость к 50 мкг/мл Km, а имеющийся в pGV 3850 neo ген канамицина функционирует в растениях, а в бактериях обеспечивает устойчивость только к 10-12 мкг/мл Km). Клоны эксконъюгантов дополнительно тестируют на способность утилизировать ксилозу.

Штаммы агробактерий с фенотипом xyl⁺, обозначенным как A. tumefaciens C58Cl (pTiVY4) анализируют с помощью блоттинг-гибридизации на присутствие последовательностей ДНК, гомологичных xyl-гену.

П р и м е р 2. Получение трансгенных растений.

В течение 2 сут листовые диски табака сорта Самсун инкубируют в среде MS без гормонов. MS - стандартная среда фирмы Flow Labs. По истечении 2 сут диски на несколько секунд опускают в жидкую MS, содержащую A. tumefaciens (10⁶-10⁵). После промокания стерильной фильтровальной бумагой их помещают в те же чашки и инкубируют еще в течение 3 сут при 25-28^оС. На четвертые сутки диски помещают на селективную MS-среду, содержащую 500 мкг/мл клафорана, 50 мкг/мл канамицина и 0,7-1,0 мкг/мл 6-БАП, что способствует образованию побегов. Через 2 недели среду освежают, и диски переносят в колбы. Еще через 2 недели образовавшиеся регенеранты переносят на MS-среду, содержащую 500 мкг/мл клафорана и 50 мкг/мл канамицина 500 мкг/мл клафорана и 50 мкг/мл канамицина для укоренения.

Растения анализируют на наличие активности неомицинфосфотрансферазы 11.

Анализ NPTII-активности проводят для 6 произвольно выбранных трансгенных растений по стандартной методике. В трех из шести трансформантов наблюдали активность NPTII с характеристиками, аналогичными бактериальному ферменту.

Затем проводят анализ геномной ДНК трансгенных растений с помощью блоттинг-гибридизации. Для этого выделяют геномную ДНК из листьев трех NRT⁺-трансгенных растений, рестрицируют Sau ЗА, фракционируют электрофорезом (10 мкг на пробу) переносят на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизируют с меченым по P³² SalGl-фрагментом xyl-гена. В контроле (ДНК исходной плазмиды), и трех анализированных линиях табака присутствуют характерные для xyl-гена зоны гибридизации, тогда как в нетрансформированных растениях табака гомология отсутствует.

Трансгенные растения, давшие положительный сигнал в NPT-тесте, анализируют на активность глюкозоизомеразы при 60^оС, при которой бактериальный фермент активен. Образование фруктозы из глюкозы тестируют с помощью известного цистеин-карбазольного метода. Во всех трех NPT⁺ тестированных линиях растений обнаруживается активность глюкозоизомеразы бактериального типа, тогда как в NPT^-растениях и в контрольных нетрансформированных растениях такая активность отсутствует.

П р и м е р 3. Проверка укоренения трансгенных растений.

Трансгенные растения несколько раз пассируют на МS-среде в стерильных условиях (агробактерии убивают путем добавления антибиотика клафорана - 500 мкг/мл), затем берут одинаковые по размеру и положению на растении сегменты стебля и переносят на свежую MS-среду. Трансгенные растения, в которых экспрессировался xyl-ген, начинают формировать корневую систему уже через 2-3 дня при 20^оС, тогда как у контрольных растений начало роста корней наблюдается лишь на 6-7 день.

Таким образом, в результате использования изобретения, основанного на применении рекомбинантной плазмиды и штамма агробактерий, возможно получение растений с принципиально новым признаком - ускоренным формированием корневой системы, обусловленным экспрессией бактериального гена в клетках таких трансгенных растений, причем это приобретенное свойство передается по наследству. В результате отпадает необходимость использования различных стимуляторов, обычно применяемых для ускорения укоренения. (56) DN A cloning, ed. by D. M. Glover IRL Press. Oxford Washington DC. 1985, Chapter, 4.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии высших растений. Целью изобретения является ускорение укоренения трансгенных растений. Способ заключается в том, что растения инфицируют штаммом Agrobacterium tumefaciens C58CI (pTiVY4), что позволяет получить растения, экспрессирующие ген глюкозоизомеразы под контролем нопилинсинтазного промотора. Создана рекомбинантная плазмида pTiVY4 и штамм Agrobacterium tumefaciens B-4428. В результате получают растения, способные формирователь корневую систему при черенковании в 2 раза быстрее по сравнению с нормальными растениями. 3 с. п. ф-лы.

1. Способ получения трансгенных растений, заключающийся в том, что листовой материал растения инфицируют штаммом Agrobacterium tumefaciens, селекционируют по признаку устойчивости к канамицину, отбирают и укореняют трансгенные растения, отличающийся тем, что, с целью ускоренного укоренения трансгенных растений при черенковании, для инфицирования используют штамм Agrobacterium tumefacens ВКПМ В - 4428, несущий ген глюкозоизомеразы Escherichia coli, а отбор трансгенных растений проводят с помощью блоттинг-гибридизации геномной ДНК растений с радиоактивным зондом гена глюкозоизомеразы и определения ферментативной активности глюкозоизомеразы e. coli с помощью цистеин-карбозольного метода. 2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTi VY 4, предназначенная для получения трансгенных растений размером около 200 т. п. н. , содержащая плазмидную ДНК векторной Ti-плазмиды A. tumefaciens pGV 3850 neo, в которой область Т ДНК плазмиды дикого типа pTi C58, содержащая гены опухолеобразования у растений, заменена на последовательности ДНК плазмиды pBR 322 размером 4,36 т. п. н. , и маркерный для растений ген устойчивости к канамицину-неомицинфосфатрансферазы 11 - nos/NPT11; BamH1 - Hind 11 - фрагмент ДНК E. coli дикого типа размером 2,2 т. п. н. с геном глюкозоизомеразы, встроенным в плазмиду pGN 3850 neo путем гомологичной рекомбинации под контролем напалинсинтазного nos промотора; генетические маркерные гены: Ap^R - ген устойчивости к ампициллину (карбенициллину); Km^R - ген устойчивости к канамицину; сайты рестрикции; BamH1, Hind 111; коньюгативна и переносится в любой другой штамм агробактерий, не содержащий плазмид той же группы несовместимости. 3. Штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens ВКПМ В-4428, предназначенный для получения трансгенных растений.