Рекомбинантная плазмидная ДНК pST20, кодирующая альфа-интерферон человека в растениях табака Советский патент 1992 года по МПК C12N15/21 C12N15/84 

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано при биотехнологическом производстве интерферона.

Известны методы получения продуцирующих интерферон клеток человека, бак- терИи, дрожжей.

Описан способ введения и временной экспрессии гена интерферона человека в растениях турнепса в составе вируса мозаики цветной капусты. Однако этот способ не обеспечивает встраивания и стабильного поддержания гена интерферона в геноме растения, что обусловлено использованием в качестве вектора вируса. Стабильное встраивание и экспрессию гена интерферона можно осуществить лишь путем генетической трансформации растений, как было показано для ряда других генов.

Целью изобретения является создание плазмиды, кодирующей альфа-интерферон человека в трансгенных растениях.

Преимущества трансгенных растений перед другими организмами - продуцеитами интерферона - заключаются в отсутствии необходимости использования для получения больших количеств биомассы растения продуцента дорогостоящих специального оборудования и помещений и ростовых сред, стерильных условий выращивания, высококвалифицированного персонала

Изобретение включает клонирование гена рекомбинантного альфа-интерферона человека в экспрессионный вектор pST6 под контроль сильного конститутивного промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты, передачу полученной рекомбинантной плазмиды pST20 в штамм Agrobacterium tumefaciens C158, несущий разоруженную Ti-плазмиду pGV2260, с последующей интеграцией плазмид pST20 и pGV2260, генетическую трансформацию методом листовых дисков растений Nicotiana tabacum сорта Самсун полученным штаммом агробактерий и рпенерацию на селективной среде полноценных трансгенных

XI

сл

го о

Х4

растений, продуцирующих рекомбинант- ный альфа-интерферон человека.

Пример. Клетки штаммов Е. coli K12, содержащие плазмиды pINF, pUC19 и plink (pBR322 со встроенным между сайтами EcoRI и Hind 111 полилинкером из pUC19) выращивают на полноценной питательной среде с антибиотиками 12 ч при 37°С и выделяют из Hi/ft плазмидную ДНК щелочным способом, которую затем очищают гель- фильтрацией на мини-колонке с сёф арозой 2В. 5 мкг ДНК плазмиды pINF расщепляют рестриктазами EcoRI (25ед.)и Pstl (25 ед.) 1 ч при 37°С. 2 мкг ДНК плазмиды pUC19 расщепляют рестриктазами pst I (10 ед.) и Hfndlll (10 ед.) 1,ч при 37°С. 5 мкг ДНК плазмиды pllnk расщепляют рестриктазами EcoRI (25 ед.), Hindlll (25 ед.) и Pvul (25 ед,) 1 ч при 37°С, затем гель-фильтрацией на миниколонке с сефарозой 2В отделяют малый EcoRI-Hindlll фрагмент (псГлШШКё р из pUC19) от остальных фрагментов плазмиды. Соединяют вместе пробы, содержащие малый EcoRI-Hindlll фрагмент ДНК плазмиды plink и расщепленую EcoRI и Pstl ДНК плазмиды pINF, и добавляют к ним 0,1 мкг ДНК плазмиды pUC19, расщепленную Pstl и Hindlll, депротеииизируют смесь хлороформом и осаждают этанолом 12 ч при -20°С. Осадок растворяют в 10 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCI рН 7,5, 1 мМ ЭДТА), отбирают 1/5 часть и проводят лигирование с 2,5 ед ДНХ-лигазы Т4 в 50 мкл лигазного буфера 12чпри4°С.

Лигировзнной ДНК трансформируют компетентные клетки Е. coli TGI и высевают на селективную среду ЭНДО, позволяющую по окраске колоний определить наличие вставки ДНК в плаомиду pUC19, а также содержащую ампициллин (100 мг/л) Выросшие через 48 ч при 37°С белые колонии, доля которых составляет приблизительно 30% от общего числа ампицйллинустойчи- вых трансформзнтов, очищают на той же среде до отдельных колоний и из нескольких кл онов вУделяют плазмидную ДНК, которую переваривают затем рестриктазами EcoRI, BamHl, Pstl и Hindlll. После анализа рестрицирован ной ДНК в агарозном геле отбирают варианты, у которых ген inf оказался встроен ным между двумя сайтами BamHl.

На следующем этапе из выделенного клона бактерий, а также из клеток Е. coliTGI, содержащих экспрессионный вектор рЗТб, препаративно выделяют плазмидную ДНК, как указано. 5 мкг плазмиды pUC19 со встроенным геном интерферона и 2 мкг ДНК плазмиды pST6 раещетшяют рестрик- тазой BamHl (50 ед) смешивают всю ДНК

плазмиды pUC19:inf с 0,2 мкг ДНК плазмиды pST6, хлороформируют и осаждают этанолом и растворяют осадок в 10 мкл ТЕ-буфера. 1/5 часть полученной смеси

ДНК лигируют в 10 мкл лигазного буфера с 2,5 ед. ДНК-лигазы Т4 18 ч при 4°С. Лигиро- ванной ДНК трансформируют компетентные клетки Е. coli TGI и проводят селекцию трансформантов на питательной среде с 100

0 мкг/мл ампициллина. Выросшие при 37°С в течение 16ч клоны очищают на той же среде и выделяют из них плазмидную ДНК, которую переваривают рестриктазами EcoRI, Pvull, Bglll и BamHl и отбирают клоны, в

5 которых ген интерферона встроился в вектор рЗТб в нужной ориентации,

На следующем этапе осуществляют передачу полученной рекомбинантной плазмиды pST20 из клеток Е. coll в клетки

0 агробактерий . С этой целью в питательном бульоне с а эрацией выращивают бактерии A tumefaclens C158 rifR (pGV2260), E. coll TGI (pRK2013) и Е. coli (pST20) до достижения плотности клеточной суспензии

5 108 кл/мл. Смешивают по 0,1 мл суспензии клеток всех трех штаммов и наносят на нит- роцеллюлозный фильтр, который помещают на полноценную питательную среду на 18 ч при 30°С. Бактерии смывают с фильтра и

0 высевают на селективную среду, содержащую ампициллин (100 мкг/мл), рифампицин (100 мкг/мл), с пектином и ци н (100 мкг/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Выросшие через 3 сут колонии на селективной среде при

5 30°С очищают на той же среде до отдельных коло-ний и выделяют из клеточной биомассы тотальную ДНК, 10 мкг ДНК переваривают с 20 ед рестриктазы BamHl 1 ч при 37°С, фракционируют путем электрофореза в

0 0,7% агарозном геле и переносят на нитро- целлюлозный фильтр по методу Саузерна. Проводят гибридизацию иммобилизованной на фильтре ДНК с 32Р-меченной ДНК плазмиды pST20, отмывают фильтр от не5 ,связавшейся метки и экспонируют фильтр сутки с рентгеновской пленкой. На радиоавтографе ДНК из исходного штамма агробактерий дает одну зону гибридизации с pST20, соответствующую области гена ампицилли0 нусюйчивости на плазмиде pGVC2260, a ДНК из клонов трансконъюгантов дает 3 зоны гибридизации, что доказывает интеграцию плазмид pST20 и pGV2250 в клетках агробактерий,

5Полученные штаммы агробактерий, несущие интегрированные плазмиды pST20 и pGV2260, используют для инфицирования листовых дисков табака Бактерии выращивают на минимальной среде А при 30°С и суспендируют в среде RMNO до плотности

10 кл/мл. Кусочки листьев стерильных растений табака N. tabacum сорта Самсун в возрасте 3-4 нед погружают в суспензию бактерий на 2-3 мин, промокают стерильной фильтровальной бумагой и помещают на среду RMNO, где инкубируют 2 сут в темноте при 25°С, после чего переносят на среду для органогенеза (солевая среда Му- расиги и Скуга + 1,5 мкг/мл БАП + 1 мкг/мл витамина Bi + 0,8 мкг/мл витамина Вб + 250 мкг/мл клафорана + 50 мкг/мл канами- цина) и инкубируют в светокамере с фотопериодом 16/8 ч 3 нед, Образовавшиеся побеги пересаживают на среду для укоренения, которая отличается от среды для орга- могенеза заменой БАП на 1 мкг/мл ИУК, и инкубируют еще 3 нед для ускорения побегов.

Образовавшиеся на селективной среде с канамицином растения проверяют на на- личие ДНК гена интерферона и его экспрессию. Присутствие ДИК гена интерферона в растениях определяется методом дот-гибридизации, 30 мкг тотальной ДНК, выделенной из растений-регенерантов, денатируют и наносят на нитроцеллюлозный фильтр, после чего проводят гибридизацию иммобилизованной на фильтре ДНК с Р-меченной ДНК гена интерферона (малый BamHI фрагмент плазмиды pST20) Растения, дающие гибридизационный сигнал, содержат ДНК гена интерферона человека.

Для установления транскрипции гена интерферона в трансгенных растениях выделяют тотальную РНК из листьев, фракци- онируют ее путем электрофореза в 1,2% агарозном геле при денатурирующих условиях с формальдегидом, переносят на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизуют с

Р-меченной ДНК гена интерферона. В ка- честве стандарта используют 0,1 нг ДНК малого ВатН фрагмента плазмиды pST20, а также 18S и 25S рибосомальную РНК. Вывод о транскрипции гена интерферона в трансгенных растениях делают на основа- нии появления зоны гибридизации, соответствующей молекулам РНК с размером 0,95 т.о.

Белковый продукт гена интерферона в трансгенных растениях определяют имму- нологически, используя моноклональные антитела против лейкоцитарного интерферона человека Кусочки листьев массой 100 мг растирают в ступке и экстрагируют буфером (25 мМ трис-HCI, рН 8,35; 195 мМ глицин) Обломки клеток осаждают центрифугированием, супернатанту добавляют этанол до конечной концентрации 20% и фильтруют раствор через нитроцеллюлоз- фильтр Фильтр промывают 4 раза по 5

мин раствором В (10 MM-NaH2P04/Na2HP04 0,15 М NaCI; 0,3% Твин-20; рН 7.2) На поверхность фильтра наносят 5 мкл раствора, содержащего моноклональные антитела против лейкоцитарного интерферона человека и инкубируют 12 ч при 4°С. Фильтр промывают 4 раза по 5 мин в растворе В и наносят на него 5 мкл раствора меченных антител против IgG мыши. Инкубируют 30 мин при 20°С и промывают антитела на фильтре 4 раза по 5 мин раствором В. Связавшиеся антитела визуализируют, освещая фильтр длинноволновым УФ-светом. В качестве стандарта используют 500 ед. лейкоцитарного интерферона человека. О продукции трансгенными растениями белка интерферона свидетельствует появление яркого флюоресцентного свечения препаратов на фильтрах.

Среда RMNO: 1х макросоли, 1х микросоли, 1 мг/л Fe-хелат, 440 мг/л CaCIa, 100 мг/л-мезоинозит, 1 мг/л витамин В1, 0,1 мг/л 2,4-Д, 0,04 мг/л кинетин, 3 мг/л ИУК, 3% сахароза, 8 г/л агар

Среда А: 10,5 г/л НРОл. 4,5 г/л КН2Р04, 1 г/л (МНфЗО. 0,5 г/л цитрат натрия -2Н20

Питательная среда для бактерий: 10 г/л триптон, 5 г/л дрож. экстракт, 10 г/л NaCI.

Агаризованная питательная среда: мя- сопептонный агар (МПА) производства ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи,

Формула изобретения Рекомбинантная плазмидная ДНК pST20, кодирующая альфа-интерферон человека в растениях табака, размером 7,7 т.п.о , содержащая:

-BamHI - BamHI фрагмент ДНК плазмиды PINF размером 0,9 т.п о геном альфа- интерферона человека;

-BamHI - BamHI фрагмент ДНК вектора рЗТб размером 6,8 т.п о.;

-сайты рестрикции:

два сайта ECORI., один из которых расположен на расстоянии 2,6 т.п.о. от первого ECORI сайта;

-три Pvull сайта, расположенных на расстоянии 0,05,1,45 и 2,95 т.п.о. от первого ECORI сайта;

-два Hindlll сайта, расположенных на расстоянии 2,15 и 3,75 т.п.о. от первого ECORf сайта,

-два BamHI сайта, расположенных на расстоянии 2,6 и 3,5 т п.о от первого ECORI сайта;

-один 5та1 сайт, расположенный на расстоянии 3,75 т п о, от первого ECORI сайта;

-регуляторные участки:

-промотор P35S - промотор вируса мозаики цветной капусты;,

-промотор PNOS - промотор гена но- палинсинтазы из Ti-плазмиды;

.- область з мОЗ - терминатор транскрипции и сигнал полиаденилирования и РНК из З1 области гена нопэлинсинтазы Т|- плазмиды;

-область 3 OCS - терминатор транскрипции и сигнал полиаденилирования и РНК из 3 области гена октопинсинтазы TI- плазмиды;

0

-области RR и LR - правый и левый сигнальные повторы размером 25 п.о., фланкирующие Т-ДНК;

-генетические маркеры:

-ген пр t П - ген устойчивости к кана- мицину в растениях;

-ген СЬР - ген устойчивости к ампициллину в бактериях;

-ген Sm - ген устойчивости к стрептомицину в бактериях;

-ген Sp - ген устойчивости к спектино- мицину в бактериях.

Использование: при биотехнологическом производств интерферона. Сущность изобретения: клонирование гена рекомби- нантного альфа-интерферона человека в экспрессионном векторе под контролем конститутивного промотора 35S и вируса мозаики цветной капусты, передача рекомбинантной плазмиды в клетки Agrobacterium tumefaciens, несущие разоруженную Ti-плазмиду, интеграция обеих плазмид, трансформация методом листовых дисков растений табака и регенерация полноценных трансгенных растений, продуцирующих рекомбинантный альфа-интерферон человека