Способ получения S-аденозилметионина Советский патент 1990 года по МПК G01N7/00 G01N7/06 C12P19/40 

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам получения веществ, обеспечивающих процессы трансметилирования, трансаминопропилирова- ния, транссульфирования в организме и используемых в экспериментальной онкологии, генной и белковой инженерии .

Целью изобретения является увеличение выхода S-аденозилметионина на 1 г ткани печени и получение меченого радиоактивными изотопами S-аденозилметионина .с высоким включением метки.

На фиг.1 представлен график динамики изменения содержания S-аденозилметионина в ткани печени крыс пос-:

ле введения диоксипропиладенина; на фиг.2 - график динамики изменения радиоактивности функций S-аденозилметионина, полученных после хроматографии экстрактов ткани печени крыс i после внутривенного введения L-(U- С), .метионина..

Основу предлагаемого способа,обеспечивающую достижение поставленной цели, составляет предварительное (за 2-6 ч до забоя) внутрибрюшинное введение крысам производного аденина (диоксипропиладенина), который способствует накоплению S-аденозилметионина в клеткйх печени..Данный прием .позволяет получить 6 кратное увелиел ел

1C

о J

со

чение количества S-аденозилметионина на 1 г печени крыс по сравнению с известным способом. Получение в этих условиях меченого соединения обеспечивается за счет внутривенного введения 2,5 -г 10 мКи/кг массы тела животных меченого радиоактивными изотопами L-метионина за 4-6 кин до забоя.

Предлагаемый способ дает возможность получения меченого радиоактивными изотопами 8 -аденозилметиони- на с высоким уровнем включения метки Пример 1„ Самцам белых беспородных крыс весом около 200 г за 4 ч до забоя внутрибрюшинно вводят диоксипропиладенин в дозе 200 мг/кг массы тела в концентрации 200 мг/мл физиологического раствора. Затем за 20 мин до. забоя внутрибрюшинно вводят L Met в дозе 100 мг/кг массы тела . Животных забивают транслокацией шейного позвонка, извлекают печень, (охлаждают в ледяном физиологическом растворе и гомогенизируют с 1V Н00 и 4V 50%-ной трихлоруксусной кислоты. Затем гомогенат центрифугируют в течение 20 мин при 6000 об/мин, су- пернатант трижды экстрагируют 1V эфира, водную фазу фильтруют и наносят на колонку ( см) с Cellex-P,. уравновешенную 1 мК НС1„ Примеси отделяют пропусканием 100 мл 50 мМ НС1 AdoMet элюируют с 20 мл 0,5 h HCl и элюат лиофилизирукл„

Содержание AdoMet после указанных воздействий составляет в печени около 2,5 мкг/г ткани. Количественное содержание S-аденозит иетионина определяют спектрофотометрически при 257 нм„

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но для получения AdoMet, меченого радиоактивными изотопами, дополнительно за 5 мин до забоя внутривенно вводят 5 мКи/кг массы тела ВЬ- метил-1 с -AdoMet с удельной активностью 40 мкКи/ммоль. При этом выделяют около 60 мкКи DL- метил-14С -AdoMet: или 30 мкКи L-Гметил- нС AdoMet с удельной активностью около 20 мкКи/ммоль.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить 2,5 мкмоль S-аденозилметионина на 1 г ткани пе

5

0

5

0

5

0

5

0

5

чени крыс, а после введения меченого ме.тионина выделяют препараты DL- метил- CJ-S-аденоэилметионина или L- - метил- ( с -Б-аденоэилметионина с удельной активностью 20 мкКи/ммоль. Чистота продукта при этом составляет более 95%.

Полученные предлагаемым способом препараты S-аденозилметионина по своим характеристикам (степени гомогенности, удельной активности) удовлетворяют требованиям предъявляемым к этому соединению при его использовании для серийных определений активностей специфических ферментов обмена S-аденозилметионина, а также в исследованиях процессов метилирования различных клеточных метаболитов, для которых S-аденозилметионин является донором метальных групп. Кроме того, предлагаемый метод получения S-аденозилметионина характеризуется методической доступностью и быстротой.

Применение предлагаемого способа облегчит обеспечение работ в области экспериментальной онкологии и биотехнологии необходимым количеством крайне мобильного соединения - S-аденозилметионина .

Формула изобретения

1.Способ получения S-аденозилметионина, включающий внутрибрюшинное введение L-метионина, забой животного, извлечение печени, ее гомогенизирование, экстракцию эфиром, хроматографию на фосфоцеллюлозе Се11ех-Р, лиофилиэацию выделенного продукта, отличающийся тем, что,

с целью увеличения выхода S-аденозилметионина на 1 г ткани печени, за 2-6 ч до забоя животным вводят диоксипропиладенин в дозе 150 - 250 мг/кг массы тела в концентрации 150-250 мг/мл физиологического раствора.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью получения меченого изотопами S-аденозилметионина с высоким уровнем включения метки, за 4-6 мин до забоя животным дополнительно внутривенно вводят 2,5-10 мКи/кг массы тела меченого радиоактивными изотопами L-метионина „

1

Изобретение относится к биохимии, в частности к биотехнологическим способам получения значительных количеств как немеченных, так и меченных радиоактивными изотопами препаратов S-аденозилметионина. Цель изобретения - увеличение выхода S-аденозилметионина на 1 г ткани печени и получение меченного радиоактивными изотопами S-аденозилметионина с высоким включением метки. Цель достигается путем внутрибрюшинного введения животным за 2 - 6 ч до забоя 150 - 250 мг/кг массы тела диоксипропиладенина и за 20 мин до забоя L-метионина в дозе 100 мг/кг массы тела, извлечения печени, гомогенизации, центрифугирования, экстракции эфиром, хроматографии на фосфоцеллюлозе CELLEX-P, элюции целевого продукта и лиофилизации. Изобретение позволяет получить выход S-аденозилметионина 2,5 мкг/г ткани печени, а удельная радиоактивность меченного S-аденозилметионина достигает 20 мкКи/ммоль. Применение предлагаемого способа облегчает обеспечение работ в области экспериментальной онкологии и биотехнологии S-аденозилметионином. 2 ил.

/50 :

§

50

т

i

4 6 8 Ю Время, цин

Фиг2

1

М W 80 пин