Способ определения топографического положения поджелудочной железы у лабораторных мышей методом прижизненной лучевой визуализации в трехмодальной системе Российский патент 2024 года по МПК A61B6/03 G09B23/28 G01T1/164 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии и лучевой визуализации, и может быть использовано для прижизненной лучевой визуализации поджелудочной железы лабораторной мыши.

Востребованность методов лучевой визуализации внутренних органов лабораторных животных определяется активным внедрением в биомедицинские исследования препаратов с направленной доставкой [Mittra ES. Neuroendocrine Tumor Therapy: 177Lu-DOTATATE. AJR Am J Roentgenol. 2018; 211(2): 278-285. doi: 10.2214/AJR.18.19953. Romer A, Seiler D, Marincek N, et al. Somatostatin-based radiopeptide therapy with [177Lu-DOTA]-TOC versus [90Y-DOTA]-TOC in neuroendocrine tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2014; 41(2): 214-222. doi: 10.1007/s00259-013-2559-8]. Особенностью данных препаратов является то, что они селективно накапливаются в определенных органах мыши, которые невозможно визуализировать рутинными методами лучевой диагностики ввиду особенностей их синтопического положения. В частности, к таким органам относятся поджелудочная железа, селезенка и определенные отделы кишечного канала [INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY, Guidance for Preclinical Studies with Radiopharmaceuticals, IAEA Radioisotopes and Radiopharmaceuticals Series No. 8, IAEA, Vienna (2023); Dupont P, Warwick J. Kinetic modelling in small animal imaging with PET. Methods. 2009; 48(2): 98-103. doi: 10.1016/j.ymeth.2009.03.008; Kuntner С. Kinetic modeling in pre-clinical positron emission tomography. Z Med Phys. 2014; 24(4): 274-285. doi: 10.1016/j.zemedi.2014.02.003].

Одной из сложностей при выборе метода исследования и последующей интерпретации результатов, получаемых в процессе лучевой визуализации, является то, что существующие методы [Чернов В.И., Синилкин И.Г., Зельчан Р.В., и др. Экспериментальное изучение возможности использования 99mTc-Нанотеха для визуализации лимфатических узлов. Медицинская радиология и радиационная безопасность. 2011; 56(1): 36-42. URL: https://istina.cemi-ras.ru/publications/article/578907506/ (дата обращения: 18.09.2023); Истомина М.С. Флуоресцентная визуализация биологических объектов, меченных наночастицами. Наука настоящего и будущего. 2020; 1: 92-95; Беляева Е.В., Гущин Я.А. Методы визуализации и исследования кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани лабораторных животных. Лабораторные животные для научных исследований. 2020; 3: 68-74. doi: 10.29296/2618723Х-2020-03-09.] имеют ряд ограничений технического характера для использования у мелких лабораторных животных в эксперименте.

В частности, при применении ультразвукового исследования у мышей определить границы поджелудочной железы нельзя, а средств, усиливающих изображение нет (это не целесообразно). Кроме того, существующие в настоящее время УЗИ аппараты не могут обеспечить достаточно высокое качество получаемых изображений лабораторных мышей. Животное с наименьшим размером, которое можно исследовать данным способом - крыса весом от 300 г.

При исследовании рентгеном область поджелудочной железы у мыши не будет давать возможность проведения дифференциации ее от прилегающих органов и тканей. В случае с компьютерной томографией эксклюзивная визуализация поджелудочной железы невозможна ввиду особенностей анатомии органа.

Изображения с наилучшей контрастностью мягких тканей обеспечивает модальность магнитно-резонансной томографии (МРТ). Однако применение данной технологии может быть ограничено по различным причинам в условиях конкретного эксперимента. Одним из ограничений МРТ для лабораторных мышей является использование инородных металлических предметов (например, проводники для миографии, клипсы для лигирования, чипы для мечения животных). Аналогичное ограничение может возникнуть при установке неметаллических зондов для введения лекарственных средств, в том числе на основе парамагнетиков и платины [Котляров П.М, Гамова Е.В, Нуднов Н.В, и др. Магнитно-резонансная томография в визуализации органов дыхания, средостения и при некоторых патологических состояниях. Пульмонология. 1999; 4: 26-30; Устенко Ж.Ю, Гущин Я.А. Методы визуализации лимфатических сосудов и узлов крысы. Лабораторные животные для научных исследований. 2020; 4: 56-64. doi: 10.29296/2618723Х-2020-04-06]. В ситуации с использованием МРТ получить изображение поджелудочной железы можно, но провести оценку биологического распределения радиофармацевтического соединения не представляется возможным.

Таким образом, количество возможных методов лучевой визуализации органов брюшной полости лабораторной мыши сокращается. Однако исследователь может провести визуализацию в различных модальностях, дополнительно расширяя возможности методов с помощью применения рентгеноконтрастных средств. Например, в настоящее время доступно использование сразу 3 модальностей: компьютерная томография (КТ) + позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) + однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ).

При использовании позитронно эмиссионной томографии возможно получить не изображение самого органа, а того сигнала, который от нее исходит после попадания в ткани органа специфических радиофармацевтических средств. Аналогичная ситуация возникает и с однофотонной эмиссионной томографией. То есть мы видим не сам орган, а радиоактивный согнал, который от него исходит. Применение нескольких модальностей сразу, прежде всего компьютерной томографии с позитронно-эмиссионной или однофотонной эмиссионной томографией, позволяет определить и анатомию органа, и количество радиации, который он излучает после попадания в него радиофармацевтического средства. Однако, органы и ткани, находящиеся рядом с железой могут изменять картину на сканах - например, от почки или петли кишки, селезенки, желчного пузыря.

Поскольку позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) и однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) не предоставляют исследователю информации об анатомической структуре органа, в доклинических исследованиях используют комбинированные модальности ПЭТ/КТ и ОФЭКТ/КТ. В этом случае компьютерная томография (КТ) используется для того, чтобы найти анатомическое положение органа, и далее, наложив его на данные ПЭТ и/или ОФЭКТ-исследования увидеть зоны высокой или низкой интенсивности сигнала от радионуклидного трейсера. При этом исследователь для проведения КТ может использовать рентгеноконтрастные средства, которые выпускаются промышленным методом и/или разрабатываются в лаборатории. Такой сочетанный подход позволяет исследовать органы брюшной полости.

КТ-исследование позволяет определить анатомическую структуру органа без эффекта суммации, т.е. без наложения изображения одного органа на другой. Исследователь получает изображение органов животного, но с учетом низкого контрастного разрешения органы брюшной полости (печень, селезенка, поджелудочная железа, отдельные участки кишечника) не могут быть разграничены. Таким образом, получение информации о зоне интереса становится труднодостижимой целью.

Для решения вопроса о визуализации органов брюшной полости мелких лабораторных животных (мыши, крысы массой тела до 300 г) ранее были предложены методы, основанные на применении принципа «исключения пустоты». Были разработаны системы визуализации внутренних органов брюшной полости с применением флюоресцентных меток [Tuchina DK, Meerovich IG, Sindeeva OA, et al. (2021). Prospects for multimodal visualisation of biological tissues using fluorescence imaging. Quantum Electronics. 2021; 51(2): 104. doi: 10.1070/QEL17512], а также метод одномоментного внутривенного введения радиоактивного изотопа ¹⁸F и распечатанных биосовместимых частиц в желудок крыс, разработанный группой Goyanes, A. et al (2018) [Goyanes A, Fernández-Ferreiro A, Majeed А, et al. PET/CT imaging of 3D printed devices in the gastrointestinal tract of rodents. Int JPharm. 2018; 536(1): 158-164. doi: 10.1016/j.ijpharm.2017.11.055].

Кроме таких подходов использовали постмортальное определение положения поджелудочной железы. Это классические методы анатомирования, которые предполагают эвтаназию животного и осмотр трупа специалистом.

При помощи соединений, применяемых для МРТ-контрастирования и усиления сосудистого рисунка у мышей возможно получить изображение органов брюшной полости и, используя знания об их анатомии, вычислить место нахождения поджелудочной железы. Авторы исследования использовали метод определения расположения органов брюшной полости друг относительно друга, ориентируясь на усиленный сосудистый рисунок, однако работа была выполнена на трупном материале и носила скорее фундаментальный результат, так как метод оказался не пригоден для дальнейшего исследования в доклинических практических исследованиях.

Исследования, проведенные на мышах, показали возможность визуализации области поджелудочной железы в толще тела животного, так как вводимый ими препарат был высокоспецифичен к бетта-клеткам островков Лангерганса. Это исследование показало принципиальную возможность рассмотреть область нахождения поджелудочной железы в теле животного, но не дало никакого понимания о его пространственном размещении относительно иных органов, так как не позволяло определить их взаиморасположения [Kuss М, Crawford AJ, Alimi OA, et al. Three-Dimensional Printed Abdominal Imaging Windows for In Vivo Imaging of Deep-Lying Tissues. Machines. 2022; 10(8): 697. doi: 10.3390/machines10080697; Faintuch BL, Faintuch S. Progress in Noninvasive Beta-Cell Mass Imaging. 2020: 631-639. In: Faintuch, J., Faintuch, S. (eds) Obesity and Diabetes. Springer, Cham. doi: 10.1007/978-3-030-53370-0_46.].

Ранние исследования, проведенные группой Ishiwata, K. et al (1991) на мышах [Ishiwata K, Ido Т, Kawamura М, et al. 4-Borono-2-[18F]fluoro-D,L-phenylalanine as a target compound for boron neutron capture therapy: tumor imaging potential with positron emission tomography. Int J Rad Appl Instrum B. 1991; 18(7): 745-751. doi: 10.1016/0883-2897(91)90013-b] показали, что для уточнения положения и расположения поджелудочной железы относительно других органов брюшной полости, в том числе селезенки, можно использовать метод прямой рентген-аутографии. Единственной проблемой этого метода является то, что животное перед ним должно быть убито. Таким образом, задача прижизненной визуализации решена не была.

В работе Grimm, J. et al (2003) [Grimm J, Potthast A, Wunder A, Moore A. Magnetic resonance imaging of the pancreas and pancreatic tumors in a mouse orthotopic model of human cancer. Int J Cancer. 2003; 106(5): 806-811. doi: 10.1002/ijc.l 1281] было продемонстрировано, что использование Gd-DTPA позволяет визуализировать поджелудочную железу мыши методом МРТ. Данный метод не очень доступен для рутинной работы в доклинических исследованиях, так как требует специализированной лаборатории с отсеком для содержания животных длительное время и приборной базы.

Таким образом, существует необходимость получения принципиально нового метода одновременной визуализации органов брюшной полости грызунов, в том числе мышей и крыс массой тела до 300 г, т.к. известные методы визуализации не предполагают возможности дальнейшего наблюдения за живым животным.

Задачей заявляемого изобретения является создание способа определения топографического положения поджелудочной железы у лабораторных мышей путем прижизненной лучевой визуализации.

Техническим результатом применения заявляемого изобретения является возможность определения топографического положения поджелудочной железы живой лабораторной мыши методом прижизненной лучевой визуализации.

Технический результат достигается тем, что предложен способ определения топографического положения поджелудочной железы живой лабораторной мыши методом прижизненной лучевой визуализации, основанный на последовательном исключении из области интерпретации синтопичных органов брюшной полости, изображение которых получается с помощью введения рентгеноконтрастных препаратов.

Заявляемый способ иллюстрируется фиг. 1-3.

На фиг. 1 представлена схема и последовательность применяемых методов визуализации поджелудочной железы у живой мыши, которая осуществляют следующим образом:

1. Животное взвешивают;

2. Внутривенно вводят контрастное средство на основе наночастиц золота для обнаружения селезенки и печени на КТ-сканах;

3. Перорально вводят эмульсию «Ультравист-Кисель» для обнаружения желудка и петель кишки методом КТ;

4. Внутривенно вводят «Ультравист-300» для обнаружения почек методом КТ;

5. Внутривенно вводят 18Р-борфенилаланин для обнаружения поджелудочной железы методом ПЭТ;

6. Проводят компьютерную обработку изображений для вычисления истинной топографии поджелудочной железы.

На фиг. 2 (А-Д) представлены этапы визуализации органов брюшной полости и забрюшинного пространства мыши.

На фиг. 3 (А1-В3) - процесс лучевой визуализации поджелудочной железы мыши.

Учитывая особенности анатомического положения поджелудочной железы грызунов, и, в частности, мышей, в целях визуализации поджелудочной железы необходимо установить синтопические границы органов, которые анатомически интимно к ней прилегают и мешают ее идентификации на получаемых томограммах. К таким органам относятся печень (одна из долей), селезенка, желудок и петли кишки. Для того чтобы визуализировать в теле животного желудок, маркировали рентгеноконтрастным средством, которое вводили через зонд перорально. При прохождении контрастного средства через желудок и петли кишки динамически определяли их положение в брюшной полости. Для визуализации всей толщи селезенки мы использовали наночастицы золота с диаметром до 10 нм, покрытые биосовместимым полимером, которые активно накапливает селезенка и печень.

Далее, используя данные анатомических атласов, секционного материала и данные изображений, получаемых в разных модальностях методами лучевой визуализации, было получено изображение мыши, у которой можно четко установить анатомо-топографическое положение и расположение поджелудочной железы в брюшной полости (фиг. 2 и 3).

Пример заявляемого способа

Лучевая визуализация органов брюшной полости лабораторной мыши проводилась с помощью томографа MiLabs VECTOR 6. Исследование состояло из двух последовательно выполненных этапов сканирования: первый этап - микроКТ, второй этап - ПЭТ. Во время сканирования животные находились в состоянии наркоза, вызванном воздушной смесью 2% изофлурана. Контроль состояния животных осуществляли по частоте дыхания при помощи встроенного оборудования и программы Bio Vet.

Для контрастного усиления печени и селезенки за 2 суток до начала сканирования мышам внутривенно вводили 200 мкл препарата наночастиц золота с концентрацией золота ПО мг/мл. Средний размер наночастиц составлял 9 нм, покрытие - полиэтиленгликоль 2 кДа.

За сутки до сканирования для контрастного усиления всех отделов кишечника мышам перорально вводили приготовленное ex tempore йодсодержащее рентгеноконтрастное средство в виде взвеси кукурузного крахмала и рентгеноконтростного средства «Ультравист-300» - «Ультравист-кисель». Для приготовления контрастного средства официнальный препарат «Ультравист-300» разводили водой в соотношении 1:1 так, чтобы концентрация йода в растворе составила 150 мг/мл. На основе полученного раствора изготавливали препарат киселеобразной консистенции на основе крахмала кукурузного с 1% концентрацией по сухому веществу. Приготовленный препарат вводили мышам перорально через зонд в следующей дозировке: 100 мкл за 1 сутки, 150 мкл за 2 ч и 60 мкл за 15 мин до начала сканирования.

Для контрастного усиления почек за 10 мин до начала сканирования мышам внутривенно вводили 100 мкл официнального рентгеноконтрастного препарата «Ультравист 300».

Для выполнения ПЭТ-исследования мышам внутривенно вводили борфенилаланин, меченный фтором-18 (18F-БФА), в объеме 600 мкл. Введенная активность составляла 16,6 МБк на экспериментальную мышь, с учетом расчета на массу тела. Область сканирования выбирали по КТ-топограмме так, чтобы выбранная область включала все органы брюшной полости и забрюшинного пространства. Проводили последовательно КТ-сканирование и ПЭТ-сканирование, состоящее из 8 временных фреймов длительностью по 15 мин.

Реконструкция ПЭТ и КТ-изображений проводилась с помощью программы MiLabs Rec 12.00. Энергетическое окно при реконструкции составляло 511±10% кэВ. Также была использована опция коррекции распада радионуклида на начало исследования. Постобработка и анализ изображений выполнены в программе PMod.

В дальнейшем проводили сравнение данных анатомических секционных материалов и данных атласов лучевой визуализации, анатомических атласов мелких лабораторных животных с полученными изображениями.

На получаемых совмещенных ПЭТ/КТ-изображениях поджелудочная железа визуализируется в виде зоны гиперфиксации радиофармацевтического лекарственного препарата, а органы, топографически прилежащие к поджелудочной железе, накапливают рентгеноконтрастные лекарственные средства, что позволяет исключить их из зоны рассмотрения.

Результаты исследования, выполненные с использованием предлагаемого метода, представлены на фиг. 2 (изображения А-Д) и фиг. 3 (изображения А-1-В-3).

Таким образом, предложенный способ прижизненной лучевой визуализации поджелудочной железы мыши позволяет определить анатомические и динамические характеристики, охарактеризовать области накопления препарата с контрастными свойствами. Предложенный способ позволяет решить следующие задачи: установить особенности топографии поджелудочной железы; выявить и оконтурить орган для дальнейшего анализа. Данные возможно получать без выведения животных из экспериментальной работы, что актуально для отработки методик в области экспериментальной онкологии и изучения новых радиофармацевтических лекарственных средств.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии и лучевой визуализации, и может быть использовано для определения топографического положения поджелудочной железы лабораторной мыши методом прижизненной лучевой визуализации. Экспериментальным мышам за 2 суток до проведения исследования внутривенно вводят 200 мкл препарата наночастиц золота с концентрацией золота 110 мг/мл и средним размером наночастиц золота 9 нм, покрытых биосовместимым полимером. В желудок экспериментальным мышам перорально через зонд вводят рентгеноконтрастное средство, для приготовления которого рентгенконтрастный йодсодержащий препарат разводят водой так, чтобы концентрация йода в растворе составила 150 мг/мл, на основе полученного раствора изготавливают препарат киселеобразной консистенции на основе крахмала кукурузного с 1% концентрацией по сухому веществу. Рентгеноконтрастное средство вводят в несколько этапов в дозировках: 100 мкл за одни сутки, 150 мкл за 2 часа, 60 мкл за 15 мин до начала исследования. За 10 минут до исследования внутривенно вводят 100 мкл рентгенконтрастного йодсодержащего препарата с концентрацией йода 300 мг/мл. Непосредственно перед исследованием вводят радиофармацевтический лекарственный препарат, обладающий тропностью к ткани поджелудочной железы в дозе 16,6 МБк. Выполняют последовательно компьютерную томографию (КТ) и позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ), состоящую из 8 временных фреймов длительностью 15 мин в трехмодальной системе. На совмещенных ПЭТ/КТ-изображениях получают изображение поджелудочной железы в виде зоны гиперфиксации радиофармацевтического лекарственного препарата, а органы, топографически прилежащие к поджелудочной железе, накапливают рентгеноконтрастные лекарственные средства. Способ обеспечивает возможность установить особенности топографии поджелудочной железы, выявить и оконтурить орган для дальнейшего анализа за счет последовательного исключения из области интерпретации синтопичных органов брюшной полости, изображение которых получается с помощью введения рентгеноконтрастных препаратов. 3 ил., 1 пр.

Способ определения топографического положения поджелудочной железы лабораторной мыши методом прижизненной лучевой визуализации, отличающийся тем, что экспериментальным мышам за 2 суток до проведения исследования внутривенно вводят 200 мкл препарата наночастиц золота с концентрацией золота 110 мг/мл и средним размером наночастиц золота 9 нм, покрытых биосовместимым полимером; затем в желудок экспериментальным мышам перорально через зонд вводят рентгеноконтрастное средство, для приготовления которого рентгенконтрастный йодсодержащий препарат разводят водой так, чтобы концентрация йода в растворе составила 150 мг/мл, на основе полученного раствора изготавливают препарат киселеобразной консистенции на основе крахмала кукурузного с 1% концентрацией по сухому веществу, рентгеноконтрастное средство вводят в несколько этапов в дозировках: 100 мкл за одни сутки, 150 мкл за 2 часа, 60 мкл за 15 мин до начала исследования; за 10 минут до исследования внутривенно вводят 100 мкл рентгенконтрастного йодсодержащего препарата с концентрацией йода 300 мг/мл; непосредственно перед исследованием вводят радиофармацевтический лекарственный препарат, обладающий тропностью к ткани поджелудочной железы в дозе 16,6 МБк, после чего выполняют последовательно компьютерную томографию (КТ) и позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ), состоящую из 8 временных фреймов длительностью 15 мин в трехмодальной системе; на совмещенных ПЭТ/КТ-изображениях получают изображение поджелудочной железы в виде зоны гиперфиксации радиофармацевтического лекарственного препарата, а органы, топографически прилежащие к поджелудочной железе, накапливают рентгеноконтрастные лекарственные средства.