Способ получения ферментов Советский патент 1990 года по МПК C12N9/00 C12M1/02 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению биологически активных веществ непрерывным способом, и может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленности.

Целью изобретения является повышение продуктивности культур за счет

одновременного выхода нескольких целевых продуктов, синтезируемых продуцентов в разных фазах роста.

На чертеже показана схема, реализующая предлагаемый способ.

Культивирование продуцента ведут одновременно в нескольких последовательно соединенных сосудах, работающих по принципу аппарата полного вытеснения, в которых создают однонаправленный ламинарный поток (Rv12300) свежей питательной среды по поверхности фиксированного слоя мицелия. При этом с выхода одного или нескольких последующих сосудов отбирают часть культуральной жидкости, обогащают ее

КИСЛОРОДОМ И ВВОДЯТ В предыдущие СО-

суды.

По мере направленного перемещения культуральной жидкости относительно мицелия продуцента она обед- няется питательными веществами и обо, гащается продуктами метаболизма и углекислым газом,

Тем самым в каждом последующем сосуде создаются условия, отличающиеся от предыдущего в обуславливающие оп- ,ределенную физиологическую активность iкультуры и характер синтезируемых ею биополимеров.

Таким образом, повторное заведение части культуральной жидкости из последующего сосуда в предыдущий позволяет получить н последующем сосуде увеличенную концентрацию целевого метаболита, тем самым дополнительно индуцируя его биосинтез в предыду- щем сосуде, что приводит к повышению выхода целевого продукта.

Такой обратный.переток части культуральной жидкости может быть организован как между соседними (смежными) сосудами, так и через один или несколько сосудов. Этот рецикл части культуральной жидкости делает весь процесс культивирования ступенчато- управляемым, а поддержание скорости каждого из таких рециклов (в каждой паре сосудов) на определенном уровне в сумме с постоянным основным протоком культуральной жидкости через все сосуды обеспечивает стабиль- ность.каждого из состояний мицелия продуцента.

Способ осуществляют следующим образом.

Последовательно соединенные со- суды 1-5 с развитой внутренней поверхностью заполняют стерильной питательной средой до полного заполнения их геометрического объема, термостатируют, вносят инокулюм и обеспечивают рециркуляцию жидкой фазы по направлению от 1 к 5.в течение 30-40 мин для гомогенного рас- пределения инокулюма. Затем рецир

Q

$

0

5 Q

...

5

куляцию отключают, включают аэрацию воздухом, обогащенным кислородом до 30-40% от объема, со скоростью 0,4-0,6 л воздуха/л среды/мин и ведут культивирование периодическим - способом в течение 16-72 ч в зависимости от используемого штамма-продуцента.

После перехода культуры в фазу замедления роста на вход первого куль- тивиционного сосуда подают свежую питательную среду со скоростью разбавления D в диапазоне 0,01-0,2 и.. последовательно вытесняют ее и предшествовавшую ей культуральную жидкость из сосуда в сосуд в направлении от 1 к 5. В случае необходимости последовательно соединенные сосуды термостатируют при разных температурах и дополнительно обогащают импульсным введением кислорода в жид-у кую фазу на уровне от 2 до 5 сосудов. Кроме того, часть культуральной жидкости из сосуда 3 (или 4 или 5) после обогащения кислородом возвращают, например, в сосуд 2 (или 3, или 4), осуществляя частичную рециркуляцию культуральной жидкости по замкнутому контуру.

Съем целевого продукта осуществляют, например, из одного из этих сосудов в фазах его максимального выхода.

Пример 1. Культуру дрожжей Endomycopsis fibuliger 5513 в качестве продуцента амилолитических ферментов выращивали в жидкой питательной среде следующего состава, %: крахмал .кукурузный 1,0; КН2Р04 0,5; кукурузный экстракт 1,0.

Культивирование продуцента ведут в установке, состоящей из сосудов 1-4, последовательно соединенных по принципу аппарата полного вытеснения, Аэрацию осуществляют продувкой воздуха, обогащенного кислородом, из расчета 0,5 л/л/мин. Поддержание рН обеспечивают автоматической подтит- ровкой 0,5 NaOH и стабилизируют в сосудах 1 и 2 на уровне 5,5-5,6,-а в

сосудах 3 и 4 на уровне 4,5-5,0.

i

Сосуды заполняют питательной средой указанного состава, термостатируют при 30 С; вносят инокулюм и включают рециркуляцию культуральной среды на 30 мин в направлении от 1 к 4 сосуду, затем ведут процесс периодического культивирования в тече- ние 72 ч.

После этого на вход сосуда 1 подавали свежую питательную среду с D 0,1 ч и постепенно вытесняют ее в последующие сосуды. Из сосуда 4 отработанную культурапьную жидкость, обогащенную чистым кислородом, подают в сосуд 3 с ,02 ч 1 . В культу- ральной жидкости, отбиравшейся из всех четырех фаз культивирования, определяют активность глюкоамилазы и о -амилазы.

Глюкоамилазная активность достигает максимума в сосуде 2 установки и составляет 46 мкмоль/мл, что в 4 раза выше, чем при периодическом культивировании, и в 3,8 раза выше, чем при двухстадийном культивировани в ферментерах идеального смешения

Активность с -амилазы достигает максимума в сосуде 4 установки и составляет 3,4 ед/мл, что в 7 раз выше, чем при периодическом культивировании в 12 раз выше, чем при двух- стадийном культивировании в ферментерах идеального смешения.

Пример 2. Все операции как в примере 1, но отбор культуральной жидкости из сосуда 4 и подача -ее в сосуд 3 отсутствуют. Аналогично примеру 1 определяют активность глюкоамилазы и с -амилазы. Максимум глю- коамилазной активности наблюдается в сосуде 2, а максимум активности о(-амилазы в - сосуде 4. Однако числовые величины этих активностей снижаются по сравнению с примером 1: глюПример 5.-Методики и режимы

коамилазы-в 2,2 раза (20,9 мкмоль/мл), до те же что и в примере 4 с тем лишь

-амилазы - в 1,8 раза (1,88 ед/мл).

Пример 3. Все операции как в примере 1, с тем отличием, что отбор культуральной жидкости из сосуда 4 и подачу ее в сосуд 3 осуществляют с ,08 ч . Максимум глюко- амилазной активности наблюдается в сосуде 2, а максимум активности о(-амилазы в сосуде 4, Однако числовые величины этих активностей снижаются по сравнению с примером 1: глюкоамилазы - в 2,4 раза (19,16 мкмоль/мл) о(-амилазы - в 3,1 раза (1,09 ед/мл). Пример 4, Культуру актлно- мицетов Actinomyces jantinus 118 в качестве продуцента ингибитора трипсина выращивают на жидкой питательной среде следующего состава, мас.%: пептон 5,0j перевар Хоттингера 30 мл;

45

50

55

отличием, что отбор культуральной жидкости из сосуда 3 и подачу ее в сосуд 2 осуществляют с ,02 .

В результате активность ингибитора составляет в сосуде J 3 ед, в сосуде 2 5 ед, в сосуде 3 14 ед,

Пример 6, Повторяют все методики и режимы примера 4 с тем ; лишь отличием, что отбор культуральной жидкости из сосуда 3 и подачу ее в сосуд 2 осуществляют с ,05 ч

В результате активность ингибитора составляет в сосуде 1 3 ед в сосуде 2 6 ед, в сосуде 3 12 ед.

Пример 7. Повторяют все методики и режимы примера 4 с тем лишь отличием, что сосуд 3 термоста- тируют при 28°С,

0

5

0

5

0

5

глюкоза 10,0; NaCl 5,0. Стабилизи- , руют рН среды подтитровкой 0,5 н. NaOH в зоне 6,8-7,0, культивирование) осуществляют в установке, представ- , ляющей три последовательно соединенных сосуда полного вытеснения с развитой внутренней поверхностью.

Установку заполняют питательной средой указанного состава, термоста- тируют при 28&С, вносят инокулюм и включают рециркуляцию питательной среды на 30 мин по замкнутому контуру. Периодическое культивирование ч осуществляют в течение 40 ч, а затем в сосуд 1 подают свежую питательную среду с , и вытесняют жидкую фазу потоком в последующие сосуды При этом сосуды 1 и 2 термо- статируют при 28 С, а сосуд 3 - при 34°С.

Культуральную жидкость из сосуда 3 насыщают кислородом и с ,03 ч дополнительно вводят в сосуд 2 установки.

В культуральной жидкости, отбиравшейся из каждого сосуда, определяют антитрипсиновую активность по изменению эстеразной активности Трипсина, используя в качестве субстрата тоздаг- -аргининметиловый спирт,

В сосуде активность ингибито1- ра составляет 3 ед. в сосуде 2 8 ед. и в сосуде 3 18 ед, что в 4 раза выше, чем максимальная активность, достигаемая при периодическом культи- вированиио,-

1

Пример 5.-Методики и режимы

о те же что и в примере 4 с тем лишь

5

0

5

отличием, что отбор культуральной жидкости из сосуда 3 и подачу ее в сосуд 2 осуществляют с ,02 .

В результате активность ингибитора составляет в сосуде J 3 ед, в сосуде 2 5 ед, в сосуде 3 14 ед,

Пример 6, Повторяют все методики и режимы примера 4 с тем ; лишь отличием, что отбор культуральной жидкости из сосуда 3 и подачу ее в сосуд 2 осуществляют с ,05 ч I

В результате активность ингибитора составляет в сосуде 1 3 ед в сосуде 2 6 ед, в сосуде 3 12 ед.

Пример 7. Повторяют все методики и режимы примера 4 с тем лишь отличием, что сосуд 3 термоста- тируют при 28°С,

В результате активность ингибитора составляет в сосуде 1 3 ед, в сосуде 2 8 ед, в сосуде 3 10 ед.

Пример 8. Культуру актино- мицета Actinomyces Kurssanovii 75 в качестве продуцента хитинолитичес- ких ферментов выращивают на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: П,НР04 3,0; MgSO, 7H20 0,54 дрожжевой экстракт 0,5, размолотый хитин (частицы 250 мега) 10,0.

Культивирование продуцента ведут в установке, состоящей из 4-после- гдовательно соединенных сосудов полного вытеснения с развитой внутренней поверхностью.

Сосуды заполняют питательной средой указанного состава, термостати- руют при 30°С, вносят инокулюм и на ,30 мин выключают рециркуляцию среды по замкнутому контуру. Затем в течение 16 ч осуществляют периодическое культивирование гриба с аэрацией от 1-го к 4-му сосуду. Затем в сосуд 1 подают свежую питательную среду с ,15 и постепенно вытесняют ее в направлении сосуда 4. Часть куль- туральной жидкости с выхода сосуда 4 обогащают кислородом и с ,05 подают в сосуд 2, а термостатиро- вание сосуда 3 осуществляют при 34 С и в него дополнительно подают воздух, обогащенный кислородом до 40% со скоростью 0,1 л/л/мин.

В культуральной жидкости, отбиравшейся из каждого сосуда, определяют активность хитиназы (СН фермент) и активность СНк-фермента, расщепляющего коллоидный хитин, а также активность фермента, расщепляющего N-N-диацетилхитобиозу и другие короткие олигосахариды хитинового ряда.

Активность хитиназы (СН,,-фермент) достигает максимума в сосуде 2 и составляет 22 ед или 2,2 раза выше, чем при периодическом культивировании, а затем снижается.

Максимум активности (ЛЦ-фермента достигается в сосуде 3 и составляет 32 ед или в 4 раза выше, чем при периодическом культивировании, а максимальная активность фермента, расщепляющего короткие олиг осахариды хитинового ряда, повышается в сосуде 4 и в 2,8 раза превосходит обнаруженную при периодическом культивировании.

10

15

20

25

15553628

Пример 9, Повторяют все методики и режимы примера 8 с тем лишь отличием, что отбираемую из сосуда 4 и подаваемую в сосуд 2 культураль- ную жидкость не обогащают кислородом,

В результате максимум активности хитиназы (СН1-фермент) наблюдается в сосуде 2 и составляет 12 ед, что в 1,8 раза ниже, чем в примере 8, максимум активности СН -фермента наблюдается в сосуде 3 и составляет 15ед, что в 2,1 раза ниже, чем в примере 8, максимум активности фермента, расщепляющего короткие олигосахариды хитинового ряда, вновь наблюдается в сосуде 4, однако он в 1,5 раза ниже, чем в примере 8.

Пример 10. Повторяют все методики и режимы примера 8 с тем лишь отличием, что термостатирование сосуда 3 осуществляют при З8 с.

В результате все виды проверяемых активностей в сосудах, за исключением первого, снизилась ориентировочно в 4-5 раз по сравнению с примером 8.

Предлагаемый способ позволяет управлять биосинтезом ферментов на каждой фазе роста продуцента, разделить выход целевых продуктов по отдельным стадиям и повысить их выход в несколько раз по сравнению с известными способами при периодическом и двухстадийном батарейном культивировании мицелиальных форм микроорганизмов.

Формула изобретения

Способ получения ферментов, предусматривающий многофазовое культивирование мицелиальных форм микроорганизмов на жидких питательных средах путем фиксации продуцентов на внутренних поверхностях ферментера и перемещения относительно них жидкой и газообразной фаз питательной среды с последующей стабилизацией культур в заданном физиологическом состоянии и оптимизацией параметров условий биосинтеза ферментов до максимального накопления их активности, отличающийся тем, что, с целью повышения продуктивности культур за счет одновременного выхода нескольких целевых продуктов, синтезируемых продуцентами в разных фазах роста, культивирование ведут

30

35

40

45

50

одновременно в нескольких последовательно соединенных сосудах, работающих по принципу аппаратов полного вытеснения, в условиях однонаправленного ламинарного потока свежей питательной среды, при этом на выходе каждого из сосудов отбирают часть культуральной жидкости, равной по

объему подаваемой свежей питательной- среды, аэрируют ее и вновь подают в сосуд с последующим отбором и выделением целевых продуктов,в стадии их максимального образования, причем в каждом иэ сосудов поддерживают параметры, оптимальные для биосиятеэа соответствующих ферментов.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению биологически активных веществ непрерывным способом и может быть использовано в микробиологической и медицинской отраслях промышленности. Целью изобретения является повышение продуктивности мицелиальных микроорганизмов - продуцентов ферментов за счет одновременного выхода нескольких целевых продуктов, синтезируемых продуцентом в разных фазах роста. Получение ферментов осуществляют путем многофазового культивирования в жидких питательных средах, которое осуществляется одновременно в нескольких последовательно соединенных сосудах, работающих по принципу аппаратов полного вытеснения, в которых создают однонаправленный ламинарный поток свежей питательной среды. При этом с выхода последующих сосудов отбирают часть культуральной жидкости, обогащают ее кислородом и подают в предыдущие сосуды, а целевые продукты отбирают по стадиям их максимального образования и выделяют известными способами, причем параметры, оптимальные для биосинтеза каждого из продуктов, поддерживают в каждом из последовательно соединенных сосудов индивидуально. Предложенный способ расширяет возможности управления микробным метаболизмом и приводит к повышению выхода целевых продуктов по сравнению с известными способами получения ферментов при периодическом и двухстадийном батарейном культивировании. 1 ил.

Питатель - пая среда