СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА БАКТЕРИАЛЬНОЙ β-АМИЛАЗЫ Российский патент 1994 года по МПК C12N9/26 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет новый способ получения бактериальной β -амилазы, который может быть использован для крупнотонажного производства ферментных препаратов β -амилазы для пищевой промышленности, детского, диетического питания и медицины.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения β-амилазы культивированием продуцента В. subtilis 2011 на крахмалсодержащей среде с последующим выделением препарата фермента из культуральной жидкости.

Недостатком известного способа являются высокие потери по активности при выделении препаратов фермента и при хранении.

Целью изобретения является новый способ получения β -амилазы культивированием бактериальных продуцентов на жидких питательных средах с крахмалом, отличающийся тем, что, с целью снижения потерь при получении препарата фермента из культуральной жидкости и при хранении в качестве продуцентов β -амилазы используют бактериальные штаммы, способные наряду с целевым ферментом синтезировать экзополисахарид, обладающий стабилизирующим действием по отношению к β-амилазе.

Способ заключается в следующем. Бактериальные штаммы продуценты β -амилазы, такие как B. polymyxa F-12, X. compestris 8162, способные к синтезу наряду с целевым ферментом экзополисахарида, обладающего стабилизирующим действием по отношению к β -амилазе, культивируют в оптимальных условиях на жидких питательных средах. Из культуральной жидкости после отделения биомассы выделяют препараты β -амилазы по известным технологическим схемам. Потери по активности в процессе получения препаратов фермента снижаются за счет стабилизирующего действия экзополисахарида, имеющегося в культуральной жидкости в количестве 5-17 мг/мл, на 10-15% , повышается стабильность при хранении в 1,1-1,2 раза.

Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что использование продуцентов, способных наряду с целевым ферментом синтезировать экзополисахарид, обладающий стабилизирующим действием по отношению к β -амилизе, обеспечивает снижение потерь при выделении препаратов ферментов и при хранении.

П р и м е р 1. Штамм B. polymyxa F-12 выращивали на среде состава: 5% крахмала, 1,5% соевой муки, 0,3% К₂НРО₄ в ферментере объемом 10 л. Количество посевного материала 2% по объему. Культивирование осуществляли при 37^оС, число оборотов мешалки 400 об/мин, воздух подавали в соотношении 1: 1. Активность β -амилазы к 30 часам составила 48 ед/мл. Выход экзополисахарида 9 мг/мл. В контроле (B. subtilis 2011, выращенном на аналогичной среде при аналогичных условиях) активность β -амилазы 50 ед/мл, выход экзополисахарида 0. Препараты β -амилазы получали осаждением этиловым спиртом в соотношении 1: 4 при 15^оС для В. polymyxa F-12 - рН 8,4, для B. subtilis 2011 pH 8,0. Результаты представлены в табл. 1.

Для доказательства влияния присутствия экзополисахарида в КЖ на уровень потерь при выделении препаратов, т. е. стабилизирующего действия экзополисахарида по отношению к β -амилазе, получены препараты β -амилазы из культуральной жидкости В. polymyxa F-12 с предварительно отделенным полисахаридом. Полисахарид выделяли при рН 6,5 этиловым спиртом в соотношении 1: 2,5. Получены также препараты B. subtilis 2011 с внесенным в культуральную жидкость экзополисахаридом (полимиксаном) в количестве 5 мг/мл. Результаты представлены в табл. 2.

Полученные данные, представленные в табл. 1 и 2, показывают, что именно присутствие экзополисахарида в КЖ продуцентов β-амилазы способствует снижению потерь при выделении препаратов фермента.

П р и м е р 2. Штамм B. polymyxa F-12 выращивали на качалочных колбах объемом 750 мл с 50 мл среды при 37^оС в течение 48 ч при числе оборотов мешалки 220 об/мин. Состав среды: 5% кукурузного крахмала, 2% соевой муки, 0,3% К₂НРО₄, начальное значение рН 7,0. Посевным материалом служила 48-часовая культура, выращенная на картофельном агаре. Количество посевного материала 4% по объему. Активность β -амилазы в КЖ 200 ед/мл. Выход экзополисахарида 17 мг/мл. Потери при выделении препарата составили 37% , выход препарата 30 г/л, активность спиртоосажденного препарата 4200 ед/г.

В контроле (B. subtilis 2011, выращенном на аналогичной среде в аналогичных условиях) активность β -амилазы в КЖ 180 кд/мл, выход экзополисахарида 0, активность препарата 5246 ед/г, выход препарата 17,5 ед/л, потери при выделении препарата 49% .

П р и м е р 3. Штамм Х. compestris 8162 культивировали как в примере 2. Активность β-амилазы в КЖ составила 190 ед/мл, выход экзополисахарида 15 мг/мл, потери при выделении препарата 35% , выход спиртоосажденного препарата 29 г/л, активность препарата 4260 ед/г. Контроль как в примере 2.

Сравнительная характеристика способов получения β -амилазы представлена в табл. 3. (в таблице сведены данные по примеру 1, 2, 3).

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом имеет следующие преимущества: снижаются потери при выделении препаратов β -амилазы из культуральной жидкости на 10-15% , увеличивается срок хранения препаратов в 1,1-1,2 раза, исключается необходимость внесения стабилизаторов и консервантов. При выделении препаратов путем спиртоосаждения экзополисахарид соосаждается с β -амилазы образуя рыхлый, белый осадок, который легко отсушивается в отличие от сырого осадка B. subtilis 2011, имеющего мазкую консистенцию, что приводит к увеличению потерь по активности на стадии отсушки. (56) Авторское свидетельство СССР N 1613491, кл. С 12 N 9/26, 1990.

Использование: биотехнология и представляет способ получения препарата бактериальной b , который может быть использовано для крупнотоннажного производства ферментных препаратов, в пищевой промышленности, медицине, детского и диетического питания. Сущность изобретения: в качестве продуцента b используют бактериальный штамм, способный на среде с крахмалом одновременно с b синтезировать экзополисахарид в количестве 5 - 17 мг/мл культуральной жидкости, обладающий стабилизирующим действием по отношению к b . Технологические преимущества способа заключаются в том, что способность продуцентов синтезировать наряду с b экзополисахарид, обладающий стабилизирующим действием, приводит к снижению потерь по активности при выделении препаратов из культуральной жидкости на 10 - 15% и увеличению срока хранения препаратов в 1,1 - 1,2 раза. Способ может найти широкое применение в производстве ферментных препаратов и обеспечит значительную экономию по сырью на 1 сл. т. 3 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА БАКТЕРИАЛЬНОЙ β-АМИЛАЗЫ, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма на жидкой питательной среде, содержащей крахмал, отделение биомассы и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью снижения потерь при выделении препарата и увеличения сроков хранения, в качестве продуцирующего микроорганизма используют бактериальный штамм, способный наряду с β -амилазой синтезировать экзополисахарид, в количестве 5 - 17 мг/мл культуральной жидкости.