Способ получения гидрохлорида @ -6-аминогексилгликозида-N-ацетилмурамоил-L-аланил-Д-изоглутамина Советский патент 1990 года по МПК C07K9/00 

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения гидрохлорида р-б-аминогексилгликозида-N- ацетилмурамоил-1.-аланил-В-изоглутами- на, который находит применение для получения кон-ьюгатов с синтетическими и природными полимерными носителями.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.

К раствору 1,9 г (16,1 ммоль) .1,6- гександиола в 20 мл сухого нитромета- на, содержащему 60 мг безводной п- толуолсульфокислоты, при перемешивании и нагревании (температура бани 80-85°С) тремя порциями в течение

6 ч добавляют раствор 5,3 г (16,1 ммоль) 2-метил-(3,4,6-три-0- ацетил-1,2-дидезокси- of-D-глюкопира- но),1-dJ-2-оксазолина в 25 мл сухого нитрометана. По окончании реакции (контроль ТСХ система 1) реакционную смесь нейтрализуют пиридином и упаривают. Колоночной хроматографией (хлороформ-«хлороформ - этанол, 30:1) выделяют 2,9 г (40%) 6-гидроксигексил- 2-ацетамидо-3,4,6-три-0-ацетил-2-деэ- окси- р-D-глюкопиранозида (1), т.пл. 90-91°С (эфир-этанол), СоИ «4-18° (С 0,87; этанол). Rf 0,40 (2).

СП

СП

00 0

го 4

ИК, CM V: 3400, 3300 (ОН, NH); 2930, 2860 (CHj); 1750, 1240 (сп. эфир); 1670, 1540 (амид).

ПМР (CDC15):1,38 м, 1,56 м (8Н, 4СН2); 1,95 с, 2,02 с, 2,03 с, 2,09 с (12Н, NAc, 3-ОАс); 4, 67 д (1Н, J,, 9 Гц; Н-1); 5,71 д (1Н, NH).

Гликозид (I) (2,4 г; 5,4 ммоль) растворяют в -25 мл сухого пиридина и при охлаждении льдом добавляют 0,62 мл (8,05 ммоль) хлористого мези- ла. Через 2 ч в реакционную смесь добавляют 1 мл воды и упаривают. Колоночной хроматографией (хлороформ- хлороформ-этанол, 50:1) вьщеляют 2,4 г (85%) мезилата (II) (6-мезилок- сигексил-2-ацетамидо-3,4,6-три-0- ацетил-2-дезокси- /з -D-глюкопиранозид) т.пл. 95-97°С (хлороформ-эфир),

Ы1 544 -15° (С 0,73; хлороформ). R,, 0,50 (2).

ИК, см- : 3310 (NH), 2930, 2840 (СНг); 1730, 1220 (ел. эфир); 1650, 1540 (амид), 1350, 1160 (SO).

К раствору 2,35 г (4,48 ммоль) мезилата (II) в 15 мл ДМФА прибавляют 1,45 г (22,4 ммоль) азида натрия и перемешивают 1 ч при 80°С. Реакционную смесь упаривают, колоночный хро- матографией (хлороформ) выделяют 2,07 г (98%) азида (III) (6-азидогек- сил-2-ацетамидо-3,4,6-три-0-ацетил- 2-дезокси- р -D-глкжопиранозид), т .пл. 85-86°С (хлороформ-гексан), S4l-17° (С 0,70; хлороформ). Rf 0,68.

ИК, см 1 ; 3290 (NH); 2930, 2850 (СН,); 2100 (азид); 1740, 1240 (ел. эфир); 1660, 1550 (амид).

К раствору 2,0 у (4,24 ммоль) ази- да (III) в 20 мл метанола добавляют 2 мл О,1 н. раствора метилата натрия в метаноле. Через 6 ч раствор нейтрализуют катионитом КУ-2 (Н4), смолу отфильтровывают, фильтрат упаривают, Получают 1,47 г (100%) соединения (IV) (6-аэидогексил-2-ацетамидо-2- дезокси- ц-D-глюкопиранозид), т.пл. 142-143°С (метанол-эфир). ГсП fU -25° (С 0,54; этанол). Rf 0,24 (3).

ИК, см- : 3340-3220 (ОН, NH);

2910; 2830 (CH,)j 2080 (азид); 1640, 1530 (амид).

К суспензии 1,40 г (4,05 ммоль) производного (IV) в 30 мл диметилаце- таля бензальдегида прибавляют 5 капель 10%-ного раствора серной кислоты в метаноле и нагревают 5 мин на масляной бане (95-100°С). Реакционную смесь охлаждают, добавпяют 100 мл гек сана. После фильтрования получают 1,61 г (92%) ацеталя (V) (6-азидогек- сил-2-ацетамидо-4,6-0-бензилиден-2- др зокси- р -D-глюкопиранозид) , т .пл. 2 5-258 С (с разл.), UJ 54« -67° (С 0,55; хлороформ). R« 0,62 (2).

ИК, см-т; 3410 (ОН); 3250 (NH); 2930, 2860 (СНа); 2100 (азид): 1630, 1570 (амид); 750, 700 (фенил).

К раствору 1,60 г (3,7 ммоль) соединения (V) в 60 мл сухого диоксана пра перемешивании добавляют 0,33 г (11,1 ммоль) гидрида натрия (80%-ная суспензия в масле). Реакционную смесь выдерживают 1 ч при 90 С, после чего охлаждают до 65°С и добавляют 0,68 мл (7,4 ммоль) L-2-хлорпропионово , кислоты. Выдержав смесь 3 ч при , добавляют 0,11 г (3,7 ммоль) гидрида натрия и еще перемешивают 1 ч. Избыток гидрида натрия разлагают добавлением 3 мл этанола. Реакционную смесь выливают в 800 мл холодной воды. Раствор подкисляют 2 н.серной кислотой до рН 2-3 и хлороформом экстрагируют выпавшую кислоту. Экстракт высушивают Na.jS04 и упаривают. Получают f,72 г (91%) кислоты (VI) Јб-азидогексил)-2- ацетамидо-4,6-0-бензилиден-2-деэокси- 3-0- (D-1 -карбоксиэтил) - /J -D-пгшкопиг ранозид), т.пл. 197-199°С, -7° (С 0,54; хлороформ). R. 0,68 (2).

ИК, см-1 :3290 (NH) ; 2950, 2870 (СН7); 2110 (азид); 1720 (), 1670, 1570 (амид); 710, 680 (фенил).

К раствору 0,70 г (1,37 ммоль) кислоты (VI) в 50 мл сухого диоксана при перемешивании и охлаждении льдом добавляют 1,19 г (1,64 ммоль) N-окси- сукцинимида и 0,35 г (1,71 ммоль) N,N -дицикл огексилкарбодиимида. Через 4 ч отфильтровывают осадок N,N -дн- циклогексилмочевины и к фильтрату добавляют 0,63 г (1,51 ммоль) трифтор ацетата) бензилового эфира L-аланил- D-изоглутамина и 0,21 мл триэтилами- на. Реакционную смесь перемешивают 24 4f упаривают и колоночной хроматографией (хлороформ- хлороформ-этанол 10:1) вьщеляют 0,93 г (85%) гликопеп- тида (VII) (бензшювый эфир 0-(6-азид гексил-2-ацетамидо-4,6-0-бензилиден-2 дезокси- р-D-глюкопиранозид-З-ил)- В-лактоил-Ь-аланил-В-изоглутамина), аморфное вещество, Cc/J (С 0,54; д 1метилформамид). Rf 0,62 (2).

ИК, см- :3390, 3260 (NH2, NH); 2920, 2850 (СН2); 2090 (азид); 1720, 1230 (ел.эфир); 1640, 1540 (амкц); 740, 690 (фенил).

ПМР (ДМСО-а):1,20 д, 1,23 д (6Н, JCH,OH 1 Гц; 2СН3СН); 1,30 м (4Н; 2СНг); 1,44-1,53 м (4Н; 2СН); 1,80 с ЗН; NAc); 2,34 т (2Н, fCH,); 4,46 д (1Н, JfiJ 8 Гц, Н-1); 5,07 с (2Н; СООСН-г); 5,68 с (1Н; СНРЬ); 7,31-7,39 м (ЮН; 2Ph); 7,08 с, 7,43 д, 7,91 д, 8,10 д (5Н, 3NH, NH,)

Гликопептид (VII) (0,40 г;

10

т.ч. на завершающих стадиях 64%. Р известном способе общий выход 7%,. ня завершающих стадиях 16%,

Полученный гидоохлопид ц -6-амино- гексилгликозид-М-ацетилмурямоил-.- аланчл-В-изоглутамин (МДП) может быть

использован для получения конъюгатов МДП с полимерными носителями.

Пример 1. К раствору 16 мг (8,3 мкг-экв) n-нитрофенилового эфира полиакриловой кислоты в 1 мл ДМФЛ добавляют 10 мг (1.6 мкмоль) гидрохлори да /ь -6-аминогексилгликозида-М-эце0,5 ммоль) растворяют при нагревании 15 тилмурамонл-Ъ-аланчл-П-изоглутамина и на кипящей бане в 10 мл 80%-ной капли триэтиламина и перемешивают

сусной кислоты и выдерживают 10 мин. Раствор упаривают, добавив 20 мл эфира осаждают 0,35 г (98%) диола (VIII)

12 ч. К раствору добавляют 0,2 мл 25%-ного раствора аммиакаР выдерживают 2 ч и гель-фильтрацией выделяют (бензиловый эфир 0-(6-азидогексил-2- 20 15 мг конъюгата 6-аминогексилгликози- ацетамидо-2-дезокси р -D-глюкопирано- да-Ы-анетилмурамоил-Ь-аланил-В-изоглу- эид-3-ил)-В-лактоил-Ь-аланилНО-изотамина с полиакоилампдом.

Пример 2. Конъюгацию 7 мг (1,1 мкмоль) гидрохлорида ft -6-амино- 25 гексилгликознца-Г -ацетилмуоамоил-Ь- 3370-3280 (ОН, NH2, NH); аланил-В-и-зоглутамина и 8 мг

(1,1 мкмоль) фосфатидидэтаноламина с 9 мг (4,6 мкг-экв) п-нитрофенилового эфира полиакриловой хислотм проводят 30 аналогично примеру 1. После гель-фильглутамина), аморфный порошок, 4.ць + +12 (С 0,69, диметилформамид). И„ 0,1 (2).

Ик,

2910, 2840 (СН2); 2080 (азид); 1710, 1230 (ел.эфир); 1640, 1530 (амид), 730, 690 (фенил).

Раствор 0,1 г (0,14 ммоль) диола

т.ч. на завершающих стадиях 64%. Р известном способе общий выход 7%,. ня завершающих стадиях 16%,

Полученный гидоохлопид ц -6-амино- гексилгликозид-М-ацетилмурямоил-.- аланчл-В-изоглутамин (МДП) может быть

использован для получения конъюгатов МДП с полимерными носителями.

Пример 1. К раствору 16 мг (8,3 мкг-экв) n-нитрофенилового эфира полиакриловой кислоты в 1 мл ДМФЛ добавляют 10 мг (1.6 мкмоль) гидрохлори да /ь -6-аминогексилгликозида-М-эце5 тилмурамонл-Ъ-аланчл-П-изоглутамина и -г капли триэтиламина и перемешивают

Изобретение относится к пептидам, в частности к получению гидрохлорида β - 6-аминогексилгликозида N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-изоглутамина, который находит применение для получения конъюгатов с синтетическими и природными полимерными носителями. Цель - повышение выхода целевого продукта. Получение ведут путем использования в оксазолиновом синтезе в качестве исходного продукта 1,6-гександиол, полученный парацетат β-6-гидроксилгликозид N-ацетилглюкозамина мезилируют хлористым мезилом в пиридине с последующим превращением мезилата в азид, бензилиденируют диметилацеталем бензальдегида без растворителя, конденсируют защищенную кислоту с трифторацетатом бензилового эфира L-ананил-D-изоглутамина с помощью N-оксисукцинимида и N,NЪ-дициклогексилкарбодиимида, бензилиденовую защиту удаляют кислотным гидролизом и гидрируют над окисью палладия в присутствии хлороформа. Способ позволяет выделить целевой продукт в виде гидрохлорида. Общий выход 22%(против 7% в известном способе).

(VIII) в смеси 15 мл этанола и 1 мл хлороформа гидрируют ..24 ч при комнатной температуре над 0,2 г окиси палладия. Катализатор отфильтровывают, промывают 5 мл этанола, фильтрат упа- ривают. Добавлением 20 мл ацетона высаживают 0,080 г (90%) производного (IX) (0-(гидрохлорид-6-аминогек- сил-2-ацетамидо-2-дезокси-р-D-глю- копиранозид-3-ил)-D-лактоил -L-ала- нил-В-изоглутамин) гидрохлорид- /а -6- аминогексилгликозида-Н-ацетилмурамоил

Пример 3. Конъюгацию 7 мг (1,1 мкмоль) гкдрохлорида р-6-амино- гексилгликозида-Н-ацетилмурамоил-Ь- аланил-В-изоглутамина и 3 мг (1,2 мкмоль) 3-аминопропил-3,6-ди-0- 40 метил- о-D-глюкопиранозида с 9 мг (4,6 мк-экв) полимера проводят аналогично примеру 1. После гель-фнльтЬ-аланил-В-изоглутамина), Г sn рации получают 12 мг (количественно) +3 (С 0,62, этанол). Rf 0,5 (4).конъюгата 6-аминогексилгликозида МЦП

ИК, см 1 : 3450-3200 (ОН, NHU, NH) 5 45 и З-амчнопропилгликозида-З.б-цн-О- 2910 (СНа), 1640, 1530 (амид) .метил глюкозы и полкакриламидом,

«С-ЯМР (MeOH-d4); 18,4 (C.-ALa), 20,1 (Cp,-lac), 23,6 (П1,,АсЧ,26,9 (C--iGlh), 27,7 (С-4) , 28,8 и 29,0 (С-2 иС-З1), 31,8 (Cj-iGln), 33,8 (С-50, 41,5 (С-6), 49,2 (), 52,5 (), 54#4 (C-2) , 57,0 (С-Г), 63,4 (С-6), 71,9 (С-4), 78,3 (С-5), 78,9 (), 82,2 (С-3), 103,9 (С-1).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет выделить р-6-амино- гексилгликозид МДП в виде устойчивого гидрохлорида. Общий выход 22%, в

Температуры плавления определяют на приборе ТТП, удельное вращение

50 при 20-22°С на поляриметре,. ПМР-спек тры получают на приборе Bruker WM- 500 (SQO МГц), внутренний стандарт . Спектр 3С-ЯМР снят на спектрометре с рабочей частотой по углеро55 ДУ 62,9 МГц, внутренний этанол (49,6 м.д. от- ) . ИК-спектры записаны на спектрофотометре (таблетки КВг). ТСХ проводят на пластинках Silufol UV-254 системы растворителей

трации получают 17 мг (количественно) конъюгата 6-аминогексилгликозида МДП и фосфатцдилэтаноламина с полиакрил- амидом .

Пример 3. Конъюгацию 7 мг (1,1 мкмоль) гкдрохлорида р-6-амино- гексилгликозида-Н-ацетилмурамоил-Ь- аланил-В-изоглутамина и 3 мг (1,2 мкмоль) 3-аминопропил-3,6-ди-0- 0 метил- о-D-глюкопиранозида с 9 мг (4,6 мк-экв) полимера проводят аналогично примеру 1. После гель-фнльтрации получают 12 мг (количественно) конъюгата 6-аминогексилгликозида МЦП

Температуры плавления определяют на приборе ТТП, удельное вращение

при 20-22°С на поляриметре,. ПМР-спек- тры получают на приборе Bruker WM- 500 (SQO МГц), внутренний стандарт . Спектр 3С-ЯМР снят на спектрометре с рабочей частотой по углероДУ 62,9 МГц, внутренний этанол (49,6 м.д. от- ) . ИК-спектры записаны на спектрофотометре (таблетки КВг). ТСХ проводят на пластинках Silufol UV-254 системы растворителей:

хлороформ-этанол 15:1 (1) ; хлороформ- этанол, 10:1 (2); хлороформ-этанол 5:1 (3); этанол-бутанол-пиридйн-вода- уксусная кислота 100:10:10:10:3 (4). ,. Зоны обнаруживают обугливанием при 400°С. Колоночную хроматографию проводят на промытом силикагеле L 100- 250 мкм, гель-фильтрацию - на Sepha- dex G-15. Данные элементного анализаfо для всех соединений соответствуют расчетным значениям.

Фор м у ла изобретения

Способ получения гидрохлорида 1 р -6-аминогексилгликозида-Н-ацетил- мурамоил-Ь-аланил-О-изоглутамина, BKnM4aiontHft получение гликозида окса- золиновым синтезом, дезацетилирование метилатом натрия в метаноле, бёнзили,. о

5

0

денирование, алкилирование L-2-хлор- пропионовбй кислотой, конденсацию с солью бензилового эфира L-аланил- D-изоглутамина путем гидрирования над окисью палладия, отличаю-, щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве исходного продукта для проведения оксазолинового синтеза исполь - зуют 1,6-гександиол, полученный /ь -6- гидроксигексил-2-ацетамидо-3,4,б-три- О-ацетил-2-дезокси- /i -6-гидроксипи- ранозид мезилируют хлористым мезштом в пиридине с последующим превращением в азид, бензилиденирование ведут обработкой диметилацеталем бензальде- гида, конденсацию проводят в присутствии N-оксисукцинимида- или N,Nf- дициклогексилкарбодиимида и ri- -..риро- вание проводят в среде хлорофоъма.