ГЛИКОПЕПТИД ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ С ДИМЕТИЛОВЫМ ЭФИРОМ L-ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ, СТИМУЛИРУЮЩИЙ ПЕРВИЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКУЮ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ Советский патент 1994 года по МПК C07J63/00 A61K31/705 

Изобретение относится к новому биологически активному производному глицирризиновой кислоты/ конкретно к гликопептиду глицирризиновой кислоты с диметиловым эфиром L-глутаминовой кислоты общей формулы I стимулирующему первичный иммунный ответ и неспецифическую резистентность.

Известный в качестве иммуностимулятора N-ацетилмурамил-1-аланил-D-изоглутамин (МДП) (II) входит в состав пептидогликанов клеточных стенок микобактерий. Поэтому в качестве референс-препарата используют МДП в дозе 10 мкг/мышь.

Однако терапевтическое применение МДП ограничивается рядом побочных эффектов, таких как пирогенность, быстротечная лейкопения, токсичность и др.

Целью изобретения является поиск нового малотоксичного соединения в ряду гликопептидов глицирризиновой кислоты, обладающего иммуностимулирующей активностью. Поставленная цель достигается гликопептидом глицирризиновой кислоты с диметиловым эфиром L-глутаминовой кислоты формулы 1, стимулирующим первичный иммунный ответ и неспецифическую резистентность к инфекции.

Способ получения описываемого соединения заключается в том, что глицирризиновую кислоту (III) обрабатывают сначала N-гидроксисукцинимидом (HOSu) в присутствии конденсирующего агента - дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) в среде сухого тетрагидрофурана (ТГФ) при 0-5^оС в течение 3 ч, при комнатной температуре в течение 6 ч, затем выдерживают при 4-8^оС в течение 12 ч, получая трис-оксисукцинимидный эфир глицирризиновой кислоты, который отделяют от образующейся дициклогексилмочевины фильтрованием и подвергают взаимодействию с гидрохлоридом метилового эфира L-глутаминовой кислоты в присутствии триэтиламина (ТЭА) при охлаждении до 0-5^оС с последующим выдерживанием реакционной смеси при комнатной температуре 24 ч.

После завершения реакции целевой продукт (1) выделяют следующим образом.

Отгоняют растворитель в вакууме, остающийся сироп растворяют в хлористом метилене и отмывают от исходных соединений 5 % -ным раствором HCl, водой, 5 % -ным раствором NaHCO₃, и снова водой. Выход гликопептида (I), гомогенного по данным тонкослойной хроматографии, 77 % .

Острую токсичность предлагаемого соединения определяли на беспородных мышах обоего пола массой 18-20 г при однократном внутрибрюшинном введении. Вводили дозы от 100 до 600 мг/кг. Через 10-15 мин после введения токсических доз у животных наблюдались судороги, диарея, учащение дыхания, гипоксин. Смерть наступала от остановки дыхания.

Параметры токсичности вычисляли по Литчфильду и Уилкоксону. При внутрибрюшинном введении LD₅₀ = 500 (350-600) мг/кг.

Действие гликопептида (I) на первичный иммунный ответ изучали на беспородных мышах линии СВА массой 18-20 г.

Животных иммунизировали 5% -ными эритроцитами барана, через 1 сут. после иммунизации внутрибрюшинно вводили гликопептид (I) в дозах 0,5 мг/кг (1/1000 от LD₅₀), 2 мг/кг (1/250 от LD₅₀), 5 мг/кг (1/100 от LD₅₀). О действии изучаемого соединения судили по количеству антителообразующих клеток (АОК) во всей селезенке.

В качестве препарата сравнения использовали МДП, который вводили животным аналогично гликопептиду в дозе 10 мкг/мышь.

Установлено, что при внутрибрюшинном введении гликопептид (I) на беспородных мышах увеличивает количество АОК по сравнению с контролем в дозе 0,5 мг/кг в два раза, в дозах 2 и 5 мг/кг в три раза. На мышах линии СВА соединение 1 в дозе 2 мг/кг (1/250 от LD₅₀) увеличивает число АОК в два раза по сравнению с контролем и его эффект аналогичен действию МДП в дозе 1/100 от LD₅₀. Гликопептид (I) менее токсичен, чем МДП.

Защитное действие (влияние на неспецифическую резистентность к инфекции) гликопептида (I) изучали на экспериментальной инфекции, вызванной синегнойной палочкой (Pseudomonas aeruginosa). За 1 сут. до заражения животных вводили соединение (I) в дозах 2 и 5 мг/кг и внутрибрюшинно 20 тыс микробных тел. Наблюдения за животными вели в течение 10 дней.

Выживаемость животных, получавших соединение (I) в дозе 2 мг/кг 50 % , продолжительность жизни 5,6±0,9 дня. Контрольные животные погибли в течение 1-2 сут. В группе животных, получавших МДП в дозе 10 мкг/мышь (1/100 от LD₅₀), выживаемость 20 % , продолжительности жизни 2,8 ± 0,8 дня. Таким образом, соединение (I) при профилактическом введении стимулирует неспецифическую резистентность, защищая мышей от инфекции Pseudomonas aeruginosa эффективнее МДП в 2,5 раза в дозе 2 мг/г.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Влияние соединения (I) на первичный иммунный ответ изучали на 50 мышах беспородных и линии СВА методом Epive и Нордина в модификации Канингема. Мышей-самцов массой 18-20 г внутрибрюшинно иммунизировали 5% -ной взвесью эритроцитов барана. Через 1 сут. после иммунизации вводили соединение (I) в дозах 0,5 и 2 мг/кг. Через 4 сут. на 5-е определили качество АОК в селезенке.

Действие гликопептида (I) сравнивали с влиянием N-ацетил-мурамилдипептида (МДП) на этот же показатель гуморального иммунитета (см. табл. 1).

На беспородных мышах гликопептид (I) в дозе 0,5 мг/кг увеличивает количество АОК по сравнению с контролем в два раза, а в дозах 2 и 5 мг/кг - в три раза.

На мышах линии СВА соединение I в дозе 2 мг/кг увеличивает число АОК в два раза по сравнению с контролем и проявляет эффект, аналогичный МДП.

П р и м е р 2. Защитный эффект гликопептида (I) против инфекции Pseudomonas aeruginosa.

На модели экспериментальной инфекции вызванной синегнойной палочкой (Pseudomonas aer. ), изучали влияние соединения I на неспецифическую резистентность организма к инфекции.

За 1 сут. до инфицирования животным внутрибрюшинно вводили соединение I в дозах 2 и 5 мг/кг, через 1 сут. вводили внутрибрюшинно 20 тыс. микробных тел суточной культуры синегнойной палочки. Наблюдения вели в течение 10 дней. Опыты проводили на беспородных мышах-самцах массой 18-20 г. В качестве референс-вещества использовали МДП в дозе 10 мкг/мышь при внутрибрюшинном введении (см. табл. 2).

Выживаемость инфицированных животных, получавших соединение (I) в дозе 2 мг/кг, 50 % , продолжительность жизни 5,6±0,9 дня. Все контрольные животные пали в течение 1-2 сут. В группе животных, получавших МДП, выживаемость 20 % , продолжительность жизни 2,8±0,8 дня.

При профилактическом введении соединение I задерживает развитие экспериментальной инфекции, вызванной синегнойной палочкой, эффективнее, чем МДП (в 2,5 раза).

П р и м е р 3. 1-0-[(3 β, 20β) -11, 30-Диоксо-30-дезокси-30-(N-глутаминовой кислоты диметиловый эфир)-олеан-12-ен-3-ил] -2-0-[β-D-6-оксо-6-дезокси-6-(N-L-глутаминовой кислоты диметиловый эфир)-глюкопиранозил] -α-D-6-оксо-дезокси-6-(N-L-глутамино- вой кислоты диметиловый эфир)-глюкопиранозид (I).

К раствору 1,64 г (2 ммоль) глицирризиновой кислоты в 50 мл сухого тетрагидрофурана при 0-5^оС прибавляют 1,15 г (10 ммоль) N-гидроксисукцинимида и 1,3 г (6 ммоль) дициклогексилкарбодиимида и перемешивают при этой температуре 3 ч, 6 ч при комнатной температуре, выдерживают в течение 12 ч в холодильнике при 4-8^оС. Отфильтровывают осадок дициклогексил- мочевины и к фильтрату, охлажденному до 0-5^оС, прибавляют при перемешивании 1,4 г (6,5 ммоль) гидрохлорида диметилового эфира L-глутаминовой кислоты, 1,1 мл (10,8 ммоль) триэтиламина и перемешивают при комнатной температуре 24 ч. Растворитель удаляют в вакууме, остаток растворяют в хлористом метилене (200 мл), промывают раствор 5% -ной HCl, водой, 5% -ным NaHCO₃, снова водой и сушат над MgSO₄.

После упаривания растворителя в вакууме получено 2,0 г(76,9 % ) целевого гликопептида (I).

Т. пл. 103-106^оС, [α] _D²⁰ + 32,3^о (С 0,06, MeOH), R _f0,77 (хлороформ : спирт = 4 : 1, силуфол). ИК-спектр, ν, см^-1: 3650-3200 (ОН, NH), 1740 (СOOMe), 1660 (C = 0), 1540 (CONH), 1210 (C - O - C). УФ-спектр, λ_макс^МеОН: 250,5 нм (lg ε 3,95).

Найдено, % : С 58,30; Н 7,81; N 3,08.

С₆₃Н₉₉N₃O₂₅.

Вычислено, % : С 58,48; Н 7,35; N 3,25.

Таким образом, предлагаемое соединение является умеренно опасным веществом, увеличивающим количество АОК в два-три раза по сравнению с контролем. Иммуностимулирующий эффект гликопептида (I) аналогичен МДП. При профилактическом введении соединение (I) защищает мышей от инфекции Pseudomonas aer. эффективнее МДП в 2,5 раза, являясь одновременно менее токсичным веществом. (56) Насыров Х. М. , Лазарева Д. Н. Изучение противовоспалительной активности производных глицирризиновой кислоты. Фармакология и токсикология, 1980, т. 43, N 4, с. 399-404.

Насыров Х. М. , Балтина Л. А. , Кондратенко Р. М. Толстиков Г. П. Исследование противовоспалительной активности ряда уреидопроизводных пентаацетилглицирризиновой кислоты. Химико-фармацевтический журнал, 1985, N 8, с. 971-974.

Насыров Х. М. , Лазарева Д. Н. Влияние современных противовоспалительных средств на репаративную стадию воспаления. Фармакология и токсикология, 1984, N 1, с. 84-88.

C. Merser et al. Biochem. Biophys Res. Commun. 1975, v 66, N 4, p. 1316-1322.

Sh. Kusumoto et al. Bull. Chem. Soc. Japan, 1976, v. 49, N 2, p. 533-39.

Sh. Kotani et al. Biken J. , 1977, v. 20, p. 125-130.

L. Chedid et al. Biochem, Pharmacol, 1978, v. 27, p. 2183-86.

S. Kotani et al. Bihen J. , 1976, v. 19, p. 9-13.

С. A. Dinarello et al. J. infect. Dis, 1978, v. 138, p. 760-67.

Джексенбаев О. Ш. Биологические свойства синтетических гликопептидов-стимуляторов иммуногенеза неспецифической резистентности. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1981, N 8, с. 13-18.

N. K. Jerne et al. Science, 1963, v. 140, p. 405.

A. I. Cunninham, Nature, 1965, v. 207, p. 1106-1107.

Кондратенко Р. М. Азотсодержащие производные глицирризиновой кислоты - новая группа высокоэффективных веществ. Диссерт. канд. наук, Уфа, 1985.

Юханова А. Ш. Синтез новых физиологически активных производных глицирризиновой кислоты. - Уфа, 1974.

Изобретение относится к стероидоподобным гликозидам, в частности к гликопептиду глицирризиновой кислоты с диметиловым эфиром L-глутаминовой кислоты, стимулирующему первичный иммунный ответ и неспецифическую резистентность. Цель - выявление соединений, обладающих указанной активностью. Получение ведут обработкой глицирризиновой кислоты сначала N-гидроксисукцинимидом в присутствии конденсирующего агента - дициклогексилкарбодиимида в среде тетрагидрофурана. Полученный трис-оксисукцинимидный эфир глицирризиновой кислоты подвергают реакции с гидрохлоридом метилового эфира L-глутаминовой кислоты. Выход 77% . LD₅₀ = 500 мг/кг. 2 табл. Структура соединения.

Гликопептид глицирризиновой кислоты с диметиловым эфиром L-глутаминовой кислоты общей формулы

где R= L= NH-H₂)₂-COOMe
стимулирующий первичный иммунный ответ и неспецифическую резистентность.