Способ получения натриевых солей производных мурамилпептидов Советский патент 1986 года по МПК C07K9/00 A61K38/14 

1, Изобретение относится к способу получения новых биологически активных соединений, а именно натриевых солей производных мурамилпептидовобщей формулы СНгОН Ю )ОН нодУ 7 NH-CORi . -ш 3сшнг СШН-СН-СОЫН-СН -СН2СН7С (L)(D) где R,-- С,- С,-алкил; RI- водород;-CHj ; , - Ci -алкил; А- -Y-0-P-OCH2CH-CH2- 5 ONQ R(4 где YOCHj-CONH-CH CHj-, -ЩСН,,С .-NH-CH(CH3)-CONHCH2CHj-, R, - водор -0-СЧШ2)11,-СНз, О Н5--0-С-( которые могут найти применение в эк периментальной биологии и медицине Цель изобретения - получение новых производных мурамилпептидов, об ладаюрщх более высокой иммуностимул рующей активностью в сочетании с ни кой токсичностью. П Р им е Р 1. Натриевая соль Ы-ацетил-мурамил-Ъ-аланил-В-изоглут минил-Ь-аланин-2-(1 ,2 -дипальмитоил-зп-глицеро-З -фосфорил)-этиламида (I), К раствору 0,84 г (1,5 ммоль) №-ацетил-мурамил-Ь-аланил-)-изоглутаминил-1.-аланина и О,. г (2,25 ммол N-оксисукцинимида в 30 мл смеси димет ацетамид - хлороформ (2:1) при переме шивании добавляют 0,46 г (2,25 ммоль) дициклогексилкарбодиимида.Реакционн смбЪь перемешивают 5 ч,добавляют 165 5 эфира. Обрязовавиийся осадок отфильтровывают, промывают эфиром и растворяют в 5 мл диметилацетамида. Полученный раствор прибавляют по каплям к раствору 0,692 г (1,0 ммоль) 2-(l , 2 -дипальмитоил-8п-глицеро-3 -фосфорил)-этиламина и 3,5 ммоль N-этилморфолина в 25 мл: смеси, хлороформ метанол - вода (65 :25 :4). Реакционную смесь перемешивают 8 ч при 25 С, добавляют 130 мл воды и упаривают в вакууме. Оставшийся водный раствор фильтруют чефез тефлоновьш фильтр типа Millipore-Felter (5 мкм). Фильтрат подвергают диализу в .ультрафильтрационной ячейке через мембрану Amicon YJ-I 10 последовательно против 400 мл воды, 200 мл О,1 М водного раствора фосфата натрия и 850 мл воды. Внутренний диализат фильтруют через фильтр Millipore (0,45 мкм). Фильтрат подвергают сублимационной сушке, В итоге получают 1,2 г (91%) соединения 1,Мс +13,9(С 1; 10% АсОН) -9°(С 0,882; вода). Найдено, %: С 53,89; Н 8,63; N 6,40; Р 2,22; Na 1,58, ,,N,0,Na-3H O Вычислено, %: С 53,59; Н 8,75; N 6,40; Р 2,36; Na 1,75.. ИК-спектр: 3400, 2920, 2850, 1740, 1660., 1545, 1465, 1455, 1380, 1240, 1165, 1100, 1065, 950, 720 см. П Р и м е Р 2. Натриевая соль N-aцeтил-мypaмил-L-aлaншI-D-изoглутамин-2-(1 ,2 -дипальмитоил-sn-глицеро-3 -фосфорил)-этиламида (II). Из 2,0 ммоль Н-ацетил-мурамшт-Ъ-аланил-1)-изоглутамина и 1,4 ммоль 2-(1 ,2 -дипальмитоил-зп-глицеро-З -фосфорил)-этиламина аналогично примеру 1 получают 1,52 г (88%) соединения II, RI 0,31 (хлороформ - метанол - вода 65:25:4) (А) и 0,64 (хлороформ - метанол - уксусная кислота - вода 25:15:4:2) (Б). Найдено, %: С 54,63; Н 8,25; N 5,78; Р 2,40; Na 1,59; С,Н,„ 50|8™а.2, Вычислено, %: С 54,49; Н 8,35; N 5,68; Р 2,51; Ns. 1,86. Пример 3. Натриевая соль К-ацетил-дезметилг-гурамил-Ь-аланил-В-В-изоглутамин-2-( 1 ,2 -дипальмитоил-зп-глицеро-З -фосфорил)-этиламида (III). Из 1,5 ммоль N-адетил-дезметилмурамил-Ь-аланил-В-изоглутамина и 3 1,0 ммоль 2-(l,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3 -фосфорил)-этиламина ана логично примеру 1 получают 1,18 г (96%) соединения III, R 0,29 (А), 0,65 (Б) +1,0° (С 0,492; метиленхлорид - этанол 1:1). Найдено, %: С 53,67; Н 8,16; N 5,93; Р 2,40; Na 1,71; Ce Hlo-N OisPNa- 2,8 Вычислено, %: С 53,88; Н 8,25; N 5,71; Р 2,53; Na 1,88. И р и м е р 4. Натриевая соль Ы-ацетил-мурамил-Ь-аланил-В-изоглутаминил-у-окси-метилкарбонил-2-(1 , 2 -дипальмитоил-5п-глицеро-3 -фосфо рил)-этиламида (IV. Из 1,5 ммоль К-ацетил-мурамил-Ь-аланил-П-изоглутамин-Х-карбоксиметилового эфира и 1,0 ммоль 2-(1 ,2 дипальмитоил-зп-глицеро-3 -фосфорил)-этиламина аналогично примеру .получают 1,20 г (92%) соединения IV R 0,28 (А), 0,68 (Б) +15 (С 0,553; метиленхлорид - этанол 1:1). Найдено, %: С 53,21; Н 8,09; N 5,18; Р 2,38; Na 1,76; Cs8H,.3, Вычислено, %: С 53,40; Н 8,13; N 5,37; .Р 2,38; Na 1,76. ИК-спектр: 3400, 2920, 2855, 174 1665, 1550, 1470, 1380, 1240, 1170, 1100, 1065, 720 см. Пример 5. Натриевая соль К-ацетил-дезметилмурамил-Ь-аланил-В -изоглутамин-2-(3 -пальмитоил-рац-глицеро-1 -фосфорил)-этиламида (V) Из 1,5 ммоль N-ацетил-дезметилму рамил-Ь-аланил П-изоглутамина и 1,0 ммоль 2-(3 -пальмитоил-рац-глицеро-1 -фосфорил)-этиламина аналоги но примеру 1 получают-0,69 г (69%) соединения V, R 0,47 (A) -1,0° (с 0,469; метиленхлорид - эт нол 1:1). Найдено, %: С 47,22; Н-7,17; N 7,31; Р 3,01; Na 2,14; . Cj,H,jN50,PNa- 3,2 KjO Вычислено, %: С 47,08; Н 7,24; N 7,04; Р 3,12; Na 2,31. П р и м е р 6. Натриевая соль N-aцeтил-мypaмил-L-aлaнил-D-изoглютаминил-Ъ-аланил-2-(3-пальмитоил-рац-глидеро-1 -фосфорил)-этиламида (VI). Из 1,5 ммоль N-aцeтил-мypaмил-L-аланил-В-изоглутаминил-Ь-аланшта и 1,0 ммоль 2-(3 -пальмитоил-рац-глицеро-1 -фосфорил)-этиламина аналоги 054 но примеру 1 получают 0,862 г (80%) соединения VI, R 0,22 (А) ;Ип° 10,0 (С 0,404; метилеихлорид - этанол 1:1). Найдено, %: С 47,71; Н 7,81; N Р 2,71; Na 2,01; C.HrsNeOisPNa 3,1 Вычислено, %: С 47,92; Н 7,24; N 7,80; Р 2,88; Na 2,14. ПК-спектр: 3400, 2925, 2855, 1730, 1660, 1545, 1455, 1380, 1230, 1170, 1060, 960, 720 см . Пример 7. Натриевая соль Н-ацетил-дезметилмурамил-Ь-аланио-В-В-изоглутаминил-L-аланил2-(1 , 2 -ди- пальмитоил-зп-глицеро-З -фосфорил)-этиламида (VII). Из 1,5 ммбль N-ацетил-дезметилмурамшт-Ь-аланил-В-изоглутаминил-Ь-аланина и 1,0 ммоль 2-(l,2 -дипальмитоил-8п-глицеро-3 -фосфорил)-этиламина аналогично примеру 1 получают 1,065 г (82%) соединения VII, R 0,39 (А); -2,0° (С 0,542; метиленхлоридэтанол 1:1). Найдено, %: С 53,69; Н 8,02; N 6,38; Р 2,24; Na 1,60; ,,РМа Вычислено, %: С 53,47; Н 8,14; N 6,45; Р 2,38; Na 1,77. П р и м е р 8. Натриевая соль N-aцeтил-дeзмeтшIмypaмил-L-aлaнил-I -В-изоглутаминил-Ь-аланил-2-(3 -пальмитоил-рац-глицеро-1-фосфорил)-этиламида (VIII). . Из 1,5 ммоль N-ацетил-дезметилмурамил-Ь- аланил-В-изоглутаминил-Ь-аланина и 1,0 ммоль 2-(3 -пальмитоил-. -рац-глидеро-1 -фосфорил)-этиламина аналогично примеру 1 получают 0,755 г (71%) соединения VIII, R. 0,16 (А), 1}уОр -7,0 (С 0,518; метиленхлоридэтанол 1:1). Найдено, %: С 47,48; Н 7,09; N 7,80; Р 2,71; Na 2,01; « TfeNgOigPNa - 2,8 HjO. Вычислено, %: С 47,66; Н 7,19; N 7,94; Р 2,93; Na 2,17. П р и м е р 9. Натриевая соль -aцeтил-мypaмил-L-oC-aминoбyтиpиД-BВ-изоглутаминил-Ъ-аланил-2-(1 ,2 дипальмитоил-зп-глицеро-З -фосфоил )-этилмида (IX). Из 1,5 ммоль N-aцeтил-мypaмил-LсС-аминобутирил-В-изоглутаминил-Lаланина аналогично примеру 1 получают 1,198 г (89%) соединения IX, R 0,32 (А) +9,0°(С 0,415; ме тиленХпорид - этанол 1:1), Найдено, %: С 53,74; Н 8,23; N 6,04; Р 2,18; Na 1,54; CfioVe H a- 3,93 Вычислено, %: С 53,56; Н 8,18; N 6,25; Р 2,31; Na 1,71. П р и Ме р 10. Натриевая соль К-про1Шонш1 нормурамил-Ъ-аланил-П--Р-изоглутаминил-Ь -аланин 2(1,2 дипальмитоил-8п-глицеро-3 -фосфорил)-этиламида (X), Из 1,5 ммоль N-пропионил-норм фа-мил-Ь-аланил-В-изоглутамин1Ш-1-аланина, 2,25 ммоль N-оксифталимида, 2,25 ммоль дициклогексилкарбодиимида и 1,0 ммоль 2-(l,2 дипальмитоил-зп 8п глицеро-3 -фосфорил)-эт1-шамина аналогично примеру 1 получают 1,15 г 20 (.87%) соединения X, R-t 0,16 (А); ,0° (С 0,547; уксусная кислота}. Найдено, %: С 53,51; Н 8,26; N 6,14; Р 2,15; Na 1,55; ,,J,0,,PNa. 3,5 Вычислено, %: С 53,53; Н 8,,-17; N 6,35; ,Р 2,34; Na 1,74. Иммуностимулирующая активность соединений 1-Х была изучена в опытах in vivo по способности увеличивать образование антител у мьштей. Исследование проводили в сравнении с известным иммуностимулятором - N--6eHзоил-мурамил-Ь-аланил-В-изоглютамином, который является структурньааналогом описываемых соединений. Мышей иммунизировали путем внутрибрюшинного введения 10 мг БСА, Через 95 15 и 29 дней отобрали пробы сыворотки крови и исследовали их на содержание антител к БСА с помощью метода пассивной гемагглютинаьщи, В используемой дозе БСА для 5И-1вотных-. реципиентов является субиммуногенным, т.е. после его введения антитела не образуются или образуются в очень небольшом количестве При введении мышам иммуностимулирующих-веществ до или после введения антигена титр антител в сыворотке повышается, Иммуностимулирующий эМзект выражается суммой logj разностей титров за все три дня отбора проб. Соединения 1-Х- и М-бензоил-мурамил-Ь--аланил-D-изоглютамин (XI) вводили внутрибрюшино в течение 5 дней после введения БСА. Были определены дозЫз, для кот&рых сумма разностей титров на 1277905 18 то че пр 1руко чи ту -Е Ф пр 45 фо R гд 6 и 28-йдень составляет 10.Острая чность соединений 1-Х была изуна мышах. Полученные результаты ставлены в таблице. ак видно из таблицы, соединения обладают высокой иммуностимулией активностью в сочетании с низтоксичностью и по активности знально превосходят известный струкый аналог - Н-бензолил-мурамиллани.п-В-из оглютамин, рмула изобретения пособ цопучения натриевых солей зводных мурамил-пептидов общей лы СНгОН i О Ш VoH о/ьУ 7 NH-CORi H V vjCOlslH CONH-CH-COWH-CH-CFL2CH9COA (U(D) С -Сд-алкил; Rj- водород, OH,, 5 R5 С,-С4-алкил; О д у 0-р-ОСН2Ш-СН2-Р5 ONa R/ где У -.-OCH,,-CONH-CHjCHj-, -NHCHjCH,,-, -Ш-СН(СНз)-СОШСН2СН2-;

(L) -водород,

о

- 0-C-(CH2)ii,-CH ,

о

Я5--0-С-(

отличающийся тем, соединение общей формулы СНгОН J-0 U / Ш-CORi HI-CH CONH-CH-CONH-CH-CH2CH2COA (L)Ш) 127

JQ органическом растворителе, а затем с соединением общей формулы

О

H-Yi- 0-P-0-CH2-CH-CH2-R 5 - ОН i

где Y NHCHjCHj-,

20-NH-CH(OH;)-CONlICH,jCH,j-,

(L) 30 7905 где Rj, R и имеют указанные значения;А, -ОН, , -Ш-СН(СНз)СООН, 5(L) конденсируют с N-оксисукцинимидом или N-оксифталимидом в присутствии дициклогексилкарбодиимида в инертном если Л,- ОН и Y, - NHCHjCHj, если A,NH-CH(CH3)-CONHCHjCHj-, -OCHjCOOH; R. и R имеют указанные о tj a и ti I сг и полученное соединение переводят в его натриевую соль.

Изобретение касается производных пептидов,, в частности натриевых солей производных мурамилпептидов общей формулы (I) «tOH ко оЛ-он .- Z, tni-c