СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения посевного материала для производства лимонной кислоты.

Известен способ получения посевного материала для производства лимонной кислоты путем культивирования гриба Aspergillus niger P-1 на твердой питательной среде по SU, а.с. 658677, кл. C 12 K 1/02, 1975.

Полученный таким способом посевной материал имеет длинные конидиеносцы и незначительное количество спор, что свидетельствует о его невысоком качестве.

Наиболее близким аналогом по своей технической сущности является способ получения посевного материала для производства лимонной кислоты, предусматривающий выращивание спор гриба вида A. niger R-3 на питательной среде, содержащей источник углерода, азота, макро- и микроэлементы (SU, а.с. 939549, кл. C 12 P 7/48).

Посевной материал, полученный по изложенному способу, проявляет высокую биохимическую активность при засеве на мелассной среде с низкой первоначальной концентрацией сахара, не более 3% он не адаптирован к высоким первоначальным концентрациям сахара в среде.

Технический результат предлагаемого способа заключается в селекции высокоэффективного штамма-продуцента лимонной кислоты, что обеспечивает увеличение выхода лимонной кислоты.

Результат достигается тем, что в предлагаемом способе получения посевного материала для производства лимонной кислоты, предусматривающем культивирование гриба вида A. niger на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, макро- и микроэлементов, из вида A. niger используют штамм A. niger 945.

Штамм A. niger 945 был получен в результате селекции путем ступенчатой обработки N-нитрозометилмочевиной и нитронитрометилмочевиной штамма A. niger 228.

Мутантный штамм хранится в коллекции микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института биосинтеза белковых веществ (ГосНИИсинтезбелок) под номером 945.

Штамм также депонирован во ВНИИ генетики и имеет коллекционный номер ВКПМ F-710.

Культурально-морфологические признаки. Культурально-морфологические признаки продуцентов лимонной кислоты обычно изучают на двух средах: на среде Чапека-Докса и на сусло-агаре. На среде Чапека-Докса у пятисуточной культуры конидиальные головки округлой формы, в диаметре 200-220 мкм. Стеригмы однослойные, длина 10-15 мкм. Конидии светло-коричневые, круглые, в диаметре 5-10 мкм. Конидиеносцы длиной 2-3 мм.

Гигантская колония A. niger F-710, выращенная на среде Чапека-Докса, при температуре 32^oC, на пятые сутки имеет круглую форму, диаметр колоний 40-50 мм.

У пятисуточной культуры на суслоагаровой питательной среде конидиальные головки округлые, в диаметре 150-220 мкм. Везикулы вытянутой формы. Конидии светло-коричневые, круглые, в диаметре 5-10 мкм. Конидиеносцы 1-3 мм.

Гигантская колония штамма A. niger 945, выращенная на сусло-агаровой питательной среде, на 5-е сут имеет круглую форму, диаметр колонии 40-50 мм. Край колоний ровный. Субстратный мицелий складчатый. Центр колонии выпуклый с резким светло-коричневым спороношением.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм хорошо сбраживает мелассу. Выход лимонной кислоты от сахара мелассы составляет 95-100% ИЗ суммы синтезируемых органических кислот количество лимонной кислоты составляет 95-98% Процесс кислотообразования завершается в более короткие сроки, чем у исходного штамма. Биохимическая активность исходного и селекционированного штаммов представлена в табл. 1, из которой видно, что при использовании посевного материала исходного штамма средний выход лимонной кислоты от сахара мелассы составляет 89,92% при использовании посевного материала селекционированного штамма A. niger F-945 средний выход возрастает до 98,25% Отношение культуры к pH и температуре. A. niger ВКПМ F-710 хорошо растет в интервале pH от 1-11 и температуры 20-40^oC. Однако оптимальные величины pH и T накопления посевного материала, синтезирующие максимальное количество лимонной кислоты, лежат в пределах pH 6-7, а температура 30-32^oC.

Отношение к источникам углерода. Штамм ассимилирует глюкозу, сахарозу, фруктозу, мальтозу, гидролизаты растительного сырья, этанол. Усваивает минеральный и органический азот.

Всхожесть спор при суспендировании в растворе мелассы при 32^oC через 8-10 ч составляет 95-99%
Пример 1. Готовят споруляционную среду, содержащую источник углерода, азота и минеральные соли. В качестве источника углерода используют пивное сусло с содержанием СВ 8-9% К жидкой питательной среде, содержащей все указанные компоненты добавляют 2-3% агара. pH среды устанавливают 6,0. Среду засевают спорами гриба штамма A. niger ВКПМ F-710, причем споры смешивают со стерильным активным углем в соотношении 1:1. Культивирование проводят поверхностным способом, при температуре 30-32^oC, в течение 9 с. При культивировании продуцента таким способом получают 1,2 1,5 грамм спор с 1 дм² споруляционной площади.

Пример 2. Посевной материал получили и использованием штамма A. niger 228. Культивирование осуществляли на мелассной питательной среде с первоначальным содержанием сахара (редуцирующих веществ) 3% в колбах на качалке при перемешивании 260 об/мин, при pH 6,0. Температуру в первые 2 сут поддерживали на уровне 32^oC, затем снижали до 30^oC и поддерживали на этом уровне до конца процесса. Продолжительность ферментации 9 суток. Выход лимонной кислоты 93% Доля лимонной кислоты 85% Сумма щавелевой и глюконовой кислот 8%
Пример 3. Посевной материал получили при культивировании штамма A. niger 945 на сусло-агаровой питательной среде в течение 10 дней. Среду для культивирования готовили на основе мелассы с концентрацией сахара в среде 3% Культивирование осуществляли в колбах на качалке при перемешивании 260 об/мин, при pH 6,0. Температуру в первые 2 сут поддерживали на уровне 32^oС, затем снижали до 30^oC. Продолжительность культивирования 7 сут. Мицелий в период культивирования хлопьевидный, содержащий довольно большое количество шарообразных комочков. Гифы тонкие, активно ветвящиеся. Выход лимонной кислоты составил 100% Доля лимонной кислоты 98% а сумма щавелевой и глюконовой - 2%
Таким образом, при использовании посевного материала штамма Aspergillus niger 945 достигается увеличение выхода лимонной кислоты в среднем на 10% массовая доля лимонной кислоты в сумме синтезируемых кислот в среднем возрастает на 15% длительность кислотообразования снижается на 1 2 сут.

Использование: изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу посевного материала для производства лимонной кислоты. Сущность: способ предусматривает выращивание спор гриба штамма Aspergillus niger ВКПМ F-710 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли. 1 табл.

Способ получения посевного материала для производства лимонной кислоты путем выращивания спор гриба Aspergillus niger продуцента лимонной кислоты на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Aspergillus niger ВКПМ F-710.