Способ контроля процесса культивирования микроорганизмов Советский патент 1990 года по МПК C12Q1/04 

(21)4453230/30-13

(22)01.07.88

(46) 15.05.90. Бюл. № 18

(71)Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения

(72)С.В. Газенко и Н.И. Королев

(53)663.18 (088.8)

(56)Юровская Е.М. Дегидрогеназная активность бактерий, как тест для оценки токсичности химических веществ. - Гигиена и санитария, 1977, № 12, с. 69-72.

Coburn I.T., Zytle F.E., Huber D.M. - Anal chem 1985, 57, p. 1669-1673.

(54)СПОСОБ КОНТРОЛЯ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

(57)Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности,

а также к тем областям, где необходимо экспрессное определение таксономической принадлежности микроорганизмов. Цель изобретения - ускорение процесса и повышение его надежности. Способ заключается в том, что отбирают пробы, содержащие микробные клетки, разделяют их на несколько частей и добавляют в качестве субстрата соли тетраэолия - тетранитросиний тет- расолий хлористый, м-нитронеотетра- эолий фиолетовый, тетразолий фиолетовый, 4-литросиний тетразолий хлорид, неотетразолий хлорид, тетразолий фиолетовый бромид, метилтиаэолил- тетразолий бромид, регистрируют интенсивность окраски любыми методами ; определяя активность дегидрогеназ. По соотношению дегидрогеназных активностей определяют таксономическую принадлежность микроорганизмов 12 ил.

S

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности, а также к тем областям, где необходимо экспрессное определение таксономической принадлежности микроорганизмов. Цель изобретения - ускорение процесса и повышение его надежности. Способ заключается в том, что отбирают пробы, содержащие микробные клетки, разделяют их на несколько частей и добавляют в качестве субстрата соли тетразолия - тетранитросиний тетразолий хлористый, м - нитронеотетразолий фиолетовый, тетразолий фиолетовый, 4-нитросиний тетразолий хлорид, неотетразолий хлорид, тетразолий фиолетовый бромид, метилтиазолилтетразолий бромид, регистрируют интенсивность окраски любыми методами, определяя активность дегидрогеназ. По соотношению дегидрогеназных активностей определяют таксономическую принадлежность микроорганизмов. 12 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности, а также к тем областям, где требуется экспрессное определение таксономической принадлежности микроорганизмов .

Целью изобретения является ускорение процесса и повышение его надежности.

Способ заключается в том, что в качестве исследуемой группы ферментов используют дегидрогеназы, а в качестве индикаторов дегидрогеназной активности соли тетразолия.

Дегидрогеназы являются конститутивными внутриклеточными ферментами

и участвуют в цикле трикарбоновых кислот и системе переноса электронов,, т.е. присущи всем клетками являются жизненно важной частью живой клетки. Их активность значительно выше, чем активность аминопелтидаз. Они намного меньше подвергаются воздействиям извне, чем аминопептидазы. Растворы солей тетразолия являются бесцветными прозрачными жидкостями. Они гос- станавливаются дегидрогеназами в местах их локализации (митохондрии, ме- зосомы) до формазана - оптически плотного соединения. В этом случае происходит окрашивание суспензии клеток.

сл

оэ

о со

3156

Тетразолии обладают различными . окислительно-восстановительными потенциалами , проницаемостью сквозь клеточную оболочку и токсичностью в отношении различных клеток. Количество и активность дегидрогеназ с определенным окислительно-восстановительным потенциалом также различаются у групп и видов микроорганизмов.

Для определения профиля, например, чистой суспензии микроорганизмов необходимо разделить ее на несколько частей и к каждой добавить раствор соответствующей соли тетразолия Пос- ле инкубации клеток с красителями в каждой пробе развивается окрашивание. Измерение степени окрашивания на ФЭКе, спектрофотометре или визуальное сравнение позволяет делать вывод о таксономической принадлежности исследуемых клеток.

На фиг.1-12 представлены дегидро- геназные профили микроорганизмов.

Профили различных видов значительно отличаются друг от друга. Профили родственных видов более близким (Е, coli М-17, Serratia marcescens), но и им присущи за етные отличия. Некоторые клетки отличаются своей общей низкой (Torula latvica, Pseudo- monas, aurautlca ибробласты) или высокой (род Bacillus) дегидрогеназ- ной активностью. При этом профиль может быть представлен как в процентах (за 100% принимается наиболее интенсивно окрашенная проба) так и в вид отношений интенсивносте й окраски В этом случае профиль, например, принимает вид: 0,71: 0,16; 0,05: 0,06:

;0,71г 0,Ю: 0,1. Дегидрогеназные просЬили микроорганизмов могут быть использованы для экспрессного анализа колоний микро- . организмов после подроста на питательных средах на стадиях контроля исходного сырья и качества готовой продукции Создание банка профилей на те или иные микроорганизмы позволяет судить о загрязнении выращиваемой культуры микроорганизмов в ферментере посторонней микрофлорой и делать вывод о ее таксономической принадлежности.

Для оптимальной переработки исходного сырья часто используют кон сорциумы двух-трех видов микроорганизмов. Постоянный контроль их соотно тения в процессе ферментации необхо40

45

50

,- 55

О

Q

5 ,,,

35

40

45

50

55

дим для производства высокока-ествен- ной продукции.Определив профили этих видов и выявив те красители,которые окрашивают клетки одного вида и не окрашивают клетки другого вида , можно дифференцировать их и определять количество тех и других с помощью обыч- iioro микроскопа. Аналогично можно дифференцировать под микроскопом культивируемые клетки и постороннюю микрофлору.

Определение эталонного профиля.

Готовят несколько пробирок, содержащих равные по объему (1 мл) и концентрации клетки E.coli М-17 (Ю кл/мл), выращенные на МПА при 37°С и суспендированные в фосфатном буфере (рН 8,2. В каждую пробирку добавляют по 0,2 мл спиртового раствора соответствующей соли тетразолия (концентрация 1 мг/мл). Пробирки инкубируют 10 мин при 37°С на водяной бане. Затем в каждую добавляют последовательно 1 мл 10%-ного формальдегида в воде и-1 мл этанола. Полученные пробы фотометриругот. Рекомендуемая А абсорбции света 575 нм. Полученные величины поглощения представляют собой специфический профиль вида.

Используемые соли тетразолия (графики :) :

2,м-Нитронеотетразолий фиолетовый C38H2SH ,004Clt

3,Тетразолий фиолетовый C13H17N4C1

7,Тетразолий фиолетовый бромид

С43НпВгН4

8,Метилтиазолилтетразолий бромид

С nHuBr .

Пример 1. В процессе производства пивных дрожжей CSacch.carls Ъег§еиз18)может происходить загрязнение дрожжей бактериальной микрофлорой, в том числе и такой, которая с трудом определяется при микроскопиро- вании или сравнима с дрожжами по морфологии.

Для дифференциации живых бактериальных клеток от црожжей под микроскопом составляют дегидрогеназные профили пивных дрожжей и посторонней бактериальной микрофаоры (согласно

51

методике определения эталонных профилей). При рассмотрении полученных профилей обнаруживается, что все бактериальные формы интенсивно окрашиваются метилтеазолилтетразолием бромистым (МТТ ), № 8 на фиг. 1-3, 5-8 ). Клетки Sacch. carls bergeusis практически не окрашиваются этим красителем. Следовательно, при добавлении МТТ в инкубационную среду интенсивно окрасятся лишь живые бактериальные клетки, которые могут быть подсчитаны под микроскопом с помощью камеры Горяева. В поле зрения микро- скопа окрашенные живые клетки хорошо отличимы от неокрашенных частиц. Количество живых же клеток пивных дрожжей определяют путем восстановления или тетранитросинего тетразолия хлористого.

Сходным образом может быть обнаружено бактериальное загрязнение фибробластов, используемых в производстве вирусных препаратов, загряз- нение дрожжами других видов хлебных, пивных, кормовых дрожжей и т.д.

Пример 2. Для производства микробного белка часто используют консорциумы дрожжей различных таксо- комических групп, в частности виды родов Saccharomyces и Candida Многие виды этих групп ярко отличаются по способности восстанавливать раз личные тетразолии. Составление про- филей указанных микроорганизмов (по приведенной методике) показывает что Saccharomyces эффективно окрашиваются формазанами тетранитротетразо- лия хлористого и 4-нитросинего тетра- золия хлористого, Candida окрашиваются неотетразолием хлористым, п-нитро- тетразолием фиолетовым и 4-нитроси- ним тетразолием хлористым. Таким образом, с целью поддержания опти- мального соотношения этих клеток в процессе производства белка целе- - сообразно для определения Candida в смеси использовать при микроскопиро- вании п-нитротетразолий фиолетовый или неотетразолий хлористый, a Saceha romyces - тетранитротетразолий хлористый; для определения общего количества живых клеток - 4-нитросиний тетразолии хлористый - окрашивающий как те, так и другие клетки. Аналогичным образом могут быть выбраны (после определения профилей) тетра- золии, избирательно окрашивающие

936

клетки Р с icTHLe слочшк закгкгск,

используемых для приготовления i оп га, сметаны, сыра и т.д. (S.lartis S.cremoris, S.lactis и S.thermophi- lus, L. bulgaricus и L.acidophi- lus). При отсутствие четких избирательно окрашивающих красителей возможно фотометрирование смесей клеток с тетразолиями, дающими различные интенсивные окрашивания. Этим ж способом целесообразно выявление определенных санитарно-значимых и патогенных микроорганизмов в молочной продукции.

Способ может быть реализован в зависимости от конкретных требовани производства при использовании двух и более солей тетразолия.

Для регистрации образовавшегося в клетках формазана могут быть использованы различные фотометры, спектрофотометры, нефелометры, фото электроколориметры. Наблюдение и сравнение профилей и их элементов (использование определенных красителей на отдельные группы и виды клеток ) может проводиться визуально и при микроскопировании.

Предлагаемый способ отличается высокой экспрессностью, надежностью получаемого результата, экономичностью и простотой в исполнении.

Для осуществленич может быть использовано большое количество (более 30) дешевых ч устойчивых в хранении красителей, не требующих отмывки и другой обработки пробы.

Формула изобретени

Фиг. 3

8в §0

Q f Z 3

S 8 7

4193-8

фиолетовый, тетразолий синий 4-нит- росиний тетразолий хлорид, неотетра- золий хлорид, тетразолий фиолетовый бромид, метилтиазолилтетразолий бромид.

Фие4

вес. St/tttas

i 2 3 4 S $ 7 Фиг. 6

Фие.9

Фи.№

а

$

э

f

«О

S

I ,

Sl

I

«Ч