СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МИКРОБНОЙ ПОПУЛЯЦИИ Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/32 

Изобретение относится к способам исследования микроорганизмов микроскопическими методами, в частности к способам определения функционального состояния микробных популяций, и может быть использовано для оценки влияния фенотипической гетерогенности микробных культур на качество вакцин и бактерийных препаратов на основе вегетативных форм микробов.

Известны микроскопические способы изучения функционального состояния микробных популяций и их гетерогенности по размерам клеток, состоящие в измерении микробов в окрашенных мазках либо на полученных с них фотоснимках (В. Н. Иванов, Г.А.Угодчиков. Клеточный цикл микроорганизмов и гетерогенность их популяций. - Киев, Наукова думка, 1984).

Общим с заявленным свойством является этап приготовления из исследуемой суспензии препарата-мазка для микроскопического исследования. Недостатком данных способов является отсутствие достаточно строгих корреляций между размерами микробов и их функциональным состоянием. Кроме того, аналитические возможности рассматриваемых способов ограничены существенными искажениями формы микробов в процессе фиксации и окраски, а также трудоемкостью получения информации, ее зависимостью от квалификации оператора и физиологических особенностей его органов зрения.

Известны способы анализа функционального состояния микробных популяций, основанные на использовании автоматизированных микроскопов для морфометрии микробов. Например, комплекса автоматического прижизненного анализа микроорганизмов (Ю. В. Кошевой, Э.И.Лежнев, О.П.Макаров. Прижизненная морфометрия клеток. - М., Наука, 1977). Такие комплексы обеспечивают получение оперативной информации о морфометрических показателях микробов в условиях непрерывного культивирования. Для контроля состояния микробной популяции применяют усредненные характеристики - площадь клеток, их максимальный диаметр, кривые распределения размеров и коэффициент гетерогенности, представляющий собой отношение числа клеток заданной площади к общему числу измеренных микробов.

Общим с заявленным способом является этап приготовления препарата для микроскопического исследования.

Недостатки способа заключаются в использовании для оценки функционального состояния микробных популяций геометрических показателей, лишь опосредованно отражающих функции клеток. Кроме того, методу присущи погрешности, обусловленные тем, что конструктивно предусмотрено измерение клеток, движущихся в поле зрения микроскопа. Для устранения таких погрешностей требуется проведение специальных вычислительных операций.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ, основанный на использовании для оценки состояния микробных популяций эквивалентных диаметров, полученных при помощи автоматизированного микроскопа Микровидеомат-2 фирмы Opton (Германия) (А.В.Чернядьев, А.Г.Золотарев, А.Л. Ковтун. Автоматизированная морфометрия бактерий, возможности и ограничения применения. - Биотехнология, 3, 1996. - С. 56-61).

Метод включает следующие этапы:
приготовление препарата типа "раздавленная капля" из нативных микробов, не подвергавшихся цитохимической обработке. Для устранения броуновского движения микробов и обеспечения их распределения в одной плоскости на поверхность предметного стекла наносят агаровый гель. В готовом препарате капля микробной суспензии распределяется в пространстве между покровным стеклом и агаровым гелем, а микробы оказываются прикрепленными к последнему;
исследование микроскопической партии клеток методом фазового контраста;
сканирование изображения клеток на экране монитора;
обработка видеосигнала по специальной программе;
выдача информации об эквивалентных диаметрах измеряемых клеток и о показателе гетерогенности (полидиперсности), представляющем отношение среднечисленного эквивалентного диаметра к среднеобъемному.

Общим с заявляемым способом является этап приготовления препарата для микроскопического исследования.

К недостаткам прототипа следует отнести опосредованную связь эквивалентных диаметров с функциональными свойствами микробных клеток, что ограничивает информационные возможности метода.

Задачей изобретения является разработка способа оценки функционального состояния микробных популяций по цитохимическим признакам, непосредственно связанным с особенностями физиологических процессов, протекающих в клетках.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в цитохимическом способе оценки функционального состояния микробных популяций предусмотрены следующие отличия:
функциональное состояние микробной популяции контролируется подсчетом под микроскопом количества центров дегидрогеназной (дыхательной) активности в микробных клетках;
для цитохимического выявления центров дегидрогеназной активности микробы инкубируют в растворе 3(4,5-диметилтиазолил-2-)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ);
оценка функционального состояния микробной популяции производится по коэффициенту дегидрогеназной активности, который рассчитывается из результатов анализа оснащенности микробов центрами дегидрогеназной активности;
добавление к инкубационной среде раствора формалина обеспечивает фиксацию гранул формазана и инактивацию микробов.

Указанные отличия обусловлены следующими причинами:
среди реактивов, предназначенных для цитохимического исследования, соли тетразолия обеспечивают выявление не столько компанентного состава клетки, а преимущественно - окислительно-восстановительных ферментов (В.И. Бирюзова. Мембранные структуры микроорганизмов. - М., Наука, 1973). Они принимают на себя электроны, отщепляемые от окисляемого субстрата, и превращаются в формазан, отложение которого зависит от активности окислительно-восстановительных ферментов. По этой причине количество образовавшегося формазана можно рассматривать в качестве индикатора состояния ферментных систем, обеспечивающих энергетический обмен клетки;
в сравнении с другими солями тетразолия, МТТ характеризуется довольно высокой способностью диффундировать через клеточные мембраны, и высоким окислительно-восстановительным потенциалом. Образуемый им формазан накапливается в цитоплазме клеток в виде гранул, отчетливо выявляемых при помощи фазово-контрастного микроскопа. Препарат доступен, поскольку выпускается отечественной промышленностью;
после инкубации в среде, содержащей МТТ, в клетках могут образовываться одна, две, три, четыре и более гранул формазана. Функциональное состояние микробной популяции оценивается коэффициентом дегидрогеназной активности, представляющем собой взвешенную среднюю, вычисленную с учетом частот отдельных классов клеток;
сохранение микроскопической картины клеток с образовавшимися гранулами формазана и обеззараживание препарата, что необходимо при работе с патогенными микроорганизмами, обеспечивается применением формалина, который обладает не только инактивирующим действием в отношении микробов, но и способностью фиксировать биологические структуры (Э. Пирс. Гистохимия /Пер. с англ. Под ред. В.В. Португалова. - М., Изд-во иностр.лит., 1962).

Способ включает следующие этапы:
приготовление инкубационной среды;
инкубирование микробов в среде;
приготовление препарата;
анализ препарата;
расчет коэффициентов дегидрогеназной активности.

Способ выполняется следующим способом:
готовят 0,1%-ный раствор МТТ в переваре Хоттингера (аминный азот 120±10 мг%, рН (7,1±0,1) ед. рН. К нему добавляют 10%-ный раствор глюкозы в соотношении 9:1);
в пробирку с 1,0 см³ инкубационной среды добавляют 3-4 капли исследуемой микробной культуры. Полученную суспензию помещают на 30 мин в термостат при температуре (37,0±0,5)^oС. При этом происходит биохимическая реакция и содержимое пробирки окрашивается в темно-синий цвет;
после инкубирования в пробирку с суспензией добавляют 12%-ный раствор формальдегида в соотношении 1:1. Микробы в формалине выдерживают не менее 30 мин;
на поверхность предметного стекла штриховыми движениями пипетки наносят тонкий слой расплавленного 2%-ного агарового геля на физиологическом растворе;
предметное стекло с нанесенным агаровым гелем устанавливают под углом около 45^o к поверхности стола для застывания геля;
каплю микробной взвеси (около 0,005 см³) наносят на центр покровного стекла, которое помещают на агаровый гель, застывший на предметном стекле;
легким надавливанием пинцета на покровное стекло обеспечивают "раздавливание" капли в пространстве между покровным стеклом и гелем (застывший гель впитывает жидкость, окружающую бактерии, в результате чего устраняется возможность броуновского движения микробов, и они распределяются по поверхности препарата). Образовавшийся препарат "раздавленная капля" герметизируют при помощи расплавленного парафина, который наносят по краям покровного стекла. Герметизация и фиксация формальдегидом обеспечивают сохранение свойств препарата в течение трех суток;
при работе с патогенными бактериями для обеззараживания препарата, поскольку его поверхность может быть обсеменена некоторым количеством исследуемых микробов, препарат выдерживают в течение 60 мин в чашках Петри с фильтровальной бумагой, смоченной формалином;
по описанию, прилагаемому к устройству КФ-4, настраивают оптическую систему фазово-контрастного микроскопа;
на покровное стекло препарата наносят каплю иммерсионного масла, препарат помещают на предметный столик фазово-контрастного микроскопа (микроскоп МБИ-3 либо МБР, МБ-1А, Биолам Л-211; фазово-контрастное устройство КФ-4, объектив -90Х; бинокулярная насадка АУ-12, окуляры - 10Х);
фокусируют микроскоп, добиваясь при помощи микровинта четкости изображения микробов. Они выглядят в виде темных палочек и овоидов, содержащих ярко светящиеся гранулы восстановленного формазана (см. рис.1, A, В);
подсчитывают отдельно количество клеток с одной, двумя, тремя, четырьмя и более гранулами формазана. Всего требуется учесть около 500 клеток. При этом получается вариационный ряд с классами:
X₁ - количество клеток с одной гранулой формазана;
Х₂ - количество клеток с двумя гранулами формазана;
Х₃ - количество клеток с тремя гранулами формазана;
X_i - количество клеток с i гранулами формазана.

Общее количество гранул в исследованных клетках составляет:
М=1X₁+2Х₂+3Х₃+...+iX_i (1)
Коэффициент дегидрогеназной активности рассчитывают по формуле:
КДА = M/∑X_i (2)
где n - количество классов клеток по оснащенности гранулами формазана в полученном вариационном ряду.

Для сравнения чувствительности предлагаемого способа и прототипа к регистрации физиологических особенностей микробных популяций были исследованы культуры чумных микробов вакцинного штамма ЕВ, выращенные в ферментере МД-400 фирмы "Марубиси" (Япония) при скорости растворения кислорода на границе раздела фаз, равной 1,5 и 0,5 ммол•дм³•мин^-1. Культивирование проводили на среде из деионизированного соляно-кислотного гидролизата казеина с аминным азотом 145 мг% и рН 7,1 при температуре (26...28)^oС. Структурно-функциональное состояние микробов полученных культур контролировали комплексом методов. Для оценки дыхательной активности клеток в условиях стимуляции глюкозой и ингибирования цианидом калия использовали полярографический метод. Устойчивость микробов к внешним воздействиям характеризовали количеством 10% раствора додецилсульфата натрия, вызвавшему лизис 50% клеток. Состояние структуры оболочек клеток (барьерную функцию) анализировали флуорометрически по проницаемости для бромистого этидиума. Жирно-кислотный состав клеток оценивали при помощи газожидкостной хроматографии по коэффициенту ненасыщенности жидкокислотного состава. Процентное содержание живых и делящихся микробов устанавливали циторефрактометрическим методом. Размеры микробов описывали эквивалентными диаметрами, определяемыми по прототипу. Степень зрелости микробной популяции характеризовали показателем фазового состояния.

Результаты экспериментов в пяти повторностях обобщены при Р=0,95 (табл. 1).

Составляемые культуры содержали одинаковое количество живых микробов. По размерам клеток (среднелинейному эквивалентному диаметру) между ними нет принципиальных различий. Однако культуры, выращенные при скорости растворения кислорода - 0,5 ммоль•дм³•мин^-1, отличались меньшей степенью зрелости, на что указывают показатель фазового состояния и доля делящихся клеток. Микробы этих культур характеризовались пониженной устойчивостью дыхания к действию цианида калия. У них наблюдались более высокие коэффициенты стимуляции дыхания глюкозой, что свидетельствует о дисбалансе энергозависимой регуляции дыхательной активности. У микробов данных культур обнаружено большее содержание ненасыщенных жирных клеток, пониженная устойчивость к лизису и повышенная проницаемость оболочек для этидиум бромида, что характерно для микробных популяций, не достигших стационарной стадии развития.

О более высокой метаболической активности и недостаточной степени зрелости данных культур свидетельствуют в отличие от прототипа и результаты исследований по предлагаемому способу. Они показывают, что эти культуры содержали в значительно большем количестве клетки с двумя, тремя и даже четырьмя гранулами формазана и по коэффициенту дегидрогеназной активности достоверно (р<0,05) отличались от культур, выращенных при скорости растворения кислорода, равной 1,5 ммоль•дм³•мин^-1.

На возможность использования предлагаемого способа для регистрации функциональных особенностей микробных популяций указывают анализ изменений коэффициента дегидрогеназной активности и параметров кинетики роста в динамике развития глубинных культур чумных микробов вакцинных штаммов Оттен и ЕВ линии НИЭГ (табл.2).

Из данных таблицы 2 следует, что независимо от штаммовых особенностей развивающихся популяций происходят однонаправленные изменения исследованных показателей. Проведенные расчеты позволили установить наличие сильной, близкой к функциональной, корреляционной связи коэффициента дегидрогеназной активности с показателем фазового состояния и удельной скоростью роста (табл.3).

Предлагаемый способ обеспечивает регистрацию не только физиологических особенностей микробных популяций в динамике развития, но и изменения их функционального состояния под влиянием ряда неблагоприятных факторов. В частности, в процессе приготовления живой чумной сухой вакцины микробы подвергаются стрессовым воздействиям - концентрированию, введению в суспензию компонентов среды высушивания (этап приготовления вакцинной взвеси) и сублимации. В результате в популяции происходит снижение количества клеток с двумя и более гранулами формазана и уменьшается коэффициент дегидрогеназной активности (табл.4).

Диагностическая эффективность предлагаемого способа подтверждается наличием достоверных корреляционных связей между коэффициентом дегидрогеназной активности и такими прикладными показателями качества вакцины сухой живой чумной, как выживаемость микробов после сублимации, доля живых клеток в вакцине и концентрация в ней живых микробов (табл.5).

Установление корреляционных связей между коэффициентом дегидрогеназной активности и функциональными характеристиками микробов, а также накопление информации о величине этого цитохимического показателя в кондиционных и некондиционных продуктах на этапах приготовления вакцины сухой живой чумной позволили рассчитать его нормативы. Значения коэффициента дегидрогеназной активности для нативных культур, вакцинных взвесей и вакцин с надежностью 95% не должны превышать соответственно 1,68; 1,34; 1,22.

Указанные нормативы позволяют оперативно проводить технологический контроль полноценности состояния микробной популяции в процессе приготовления вакцины, альтернативно оценивать кондиционность культур, вакцинных взвесей и принимать решение о целесообразности их использования для приготовления вакцины. Применительно к вакцинам установленный норматив коэффициента дегидрогеназной активности представляет возможность прогнозирования ее сохраняемости.

Причинно-следственная связь между совокупностью заявляемого и достигаемым техническим результатом обусловлены тем, что он основан на количественной оценке оснащенности микробов центрами дегидрогеназной активности - окислительно-восстановительными ферментами, имеющими важное значение для жизнедеятельности микроорганизмов и их отношений со внешней средой.

Предлагаемый способ оценки функционального состояния микробных популяций имеет следующие преимущества:
обеспечивает проведение оценки физиологических особенностей микробов при помощи коэффициента дегидрогеназной активности, устанавливаемого на основании результатов цитохимического анализа оснащенности клеток центрами с окислительно-восстановительными ферментами;
основан на применении МТТ-препарата, выпускаемого отечественной промышленностью;
для проведения исследований методом нет необходимости в сложном аналитическом оборудовании, а достаточно обычных световых фазово-контрастных микроскопов;
выполнение анализа доступно оператору со средним специальным образованием, имеющему навыки работы с фозово-контрастными микроскопами;
способ обеспечивает достаточную для практического применения точность. Коэффициент вариации методики определения коэффициента дегидрогеназной активности не превышает 1%, а расхождение результатов анализа между лабораториями - 5%;
затраты времени на определение коэффициента дегидрогеназной активности составляет 3 часа с момента поступления пробы в лабораторию, что позволяет охарактеризовать цитохимический метод как экспрессный.

Метод применим для анализа аэробных и факультативно анаэробных микробов с той лишь особенностью, что нормативы коэффициента дегидрогеназной активности устанавливают, исходя из особенностей технологии приготовления вакцинного или диагностического препарата и после накопления базы данных о значениях цитохимического показателя в разнокачественных материалах. Возможность осуществления предложенного способа применительно к сапным и бруцеллезным микробам показано на следующих примерах.

Пример 1. Результаты определения коэффициента дегидрогеназной активности в процессе культивирования бруцеллезных микробов при приготовлении вакцины жидкой лечебной бруцеллезной (табл.6).

Пример 2. Результаты определения коэффициента дегидрогеназной активности в процессе культивирования сапных микробов для приготовления вакцины сапной жидкой культуральной инактивированной (табл.7).

Приведенные в табл. 6 и 7 данные дают основание считать, что изменения коэффициента дегидрогеназной активности в процессе культивирования сапных и бруцеллезных микробов происходят по закономерностям, выявленным у чумных микробов, и свидетельствуют о возможности применения предлагаемого способа для оценки функционального состояния микробных популяций не только Y. pestis, но и других видов бактерий.

Изобретение относится к микробиологии. Функциональное состояние микробной популяции оценивают по количеству гранул формазана в клетках при помощи фазово-контрастного микроскопа. Гранулы формазана образуются после инкулирования клеток в 0,1% растворе 3(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолия бромида на переваре Хоттингера с 0,1% глюкозы. Способ обеспечивает достаточную для практического применения точность, не требует использования сложного аналитического оборудования, прост в применении и является экспрессным. 1 ил., 7 табл.

Способ оценки функционального состояния микробной популяции, включающий приготовление препарата, исследование препарата при помощи фазово-контрастного микроскопа и количественный анализ микроскопической картины клеток, отличающийся тем, что предварительно микробную популяцию инкубируют 30 мин при температуре 37±0,5^oC в 0,1% растворе 3(4,5-диметилтиазолил-2-)-2,5 дифенилтетразолия бромида (МТТ) на переваре Хоттингера с 0,1% глюкозы, затем фиксируют микробы и стабилизируют образовавшиеся гранулы формазана добавлением 6% формальдегида, а количественный анализ микроскопической картины клеток проводят, определяя оснащенность микробов гранулами формазана, и по полученным результатам судят о функциональном состоянии микробной популяции.