Способ определения кислородных радикалов,образуемых фагоцитами Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики иммунодефицитных заболеваний.

Известны способы определения образования кислородных радикалов путем использования маркировочного вещества, при взаимодействии которого с кислородными радикалами меняются спектральные характеристики tl 3.

Однако чувствительность измерений указанным способом низка и позволяет регистрировать суммарно образование кислородных радикалов только от значительного количества клеток.

Известен также способ определения кислородных радикалов, образуемых фагоцитами, включающий вьзделение клеток, смешивание их с фагоцитируемыми частицами, добавление соли тетразолия и инкубацию реакционной смеси с последующей регистрацией кислородных радикалов, для чего в суспензию, содержащую фагоциты и фагоцитируемый материал - дрожжевые клетки, одномоментно вводят нитросини тетразолий и после инкубации материал просматривают в световой микроскоп По выпадении нерастворимого темносинего осадка определяют количество образовавшихся кислородных радикалоЕ 2 Однако нитросиний тетразолий является пригодным только для световой млкросокпии, так как получаемый с результате его восстановления продукт обладает слабой электронной плотностью. Кроме того, способ на основе световой микросокпии является неточным, позволяет получить лишь данные о наличии или отсутствии продукта реакции, не позволяет связать образование этого продукта (а следовательно, и кислородных радикалов) с определенными субклеточными образованиями, что чрезвычайно важно Для точного описания места и момента вьфаботки фагоцитом кислородных радикалов для диагностики иммунодефицитных

заболеваний.

I,.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения кислородных радикалов, образуемых фагоцитами, включающему вьщеление клеток, смешивание их с фагоцитируемыми частицами, добавление соли тетразолия и инкубацию реакционной смеси с последующей регистрацией кислородных радикалов, при котором в качестве контрастного вещества используют 150-250 мкМ тетранитросинего тетразолия, затем в ряд реакционных смесей дополнительно вводят супероксиддисмутазу от 1,1 мкг/мл до образования формазана, а количество кислородных радикалов (У) определяют по формуле

У -0,267 + 0,242 X, где X - количество супероксиддисмутазы, находящейся в пробе с образовавщимся формазаном, мкг/мл.

Способ осуществляют следзш)щим образом.

Полученные фагоцитирующие клетки в конечной концентрации 1-10 3-10 мл вносят в содержащую фагоцитируемый материал инкубационную среду следующего состава: 120-160 мМ хлорида натрия 3-7 мМ хлорида калия, 15-25 мМ Н-(2-гидроксизтил)-пиперазин-N-2-этaнocyльфoнoвoй кислоты (HEPES), 3-7 мМ глюкозы, 150-250 мкМ тетранитросинено тетразолия, имеющую рН 7,0-7,2.

После инкубаци1| в течение 15 60 мин клетки осаждают центрифугировнием, фиксируют 4%-Hbw растйором парафррмальдегида на 100 мМ какодилатном буфере, постификсируют 1%-ным раствором четырехокиси осмия на 75 мМ какодилатном буфере, обезвоживают ацетоном с возрастающей концентрацией последнего от 70 до 100%, заливают в смесь эпон-аралдит, полимерзуют в течение 48-60 ч, ультрамикротомируют и изучают в электронном микроскопе.

Указанные величины тетранитросинего тетразолия являются оптимальньми, так как превьвиение верхних пределов может приводить к неспецйфическоМу выпадению осадка, а нижние значения являются теми минимальными количествами, которые достаточны для визуализэ1;ии осадков в электронном микроскопе. Концентрационные значения хлорида натрия, хлорида калия, HEPES и глюкозы являются минимально необходимьии для создания в среде инкубации условий для поддержания жизнедеятельности фагоцитов: изотоническое давление и рН.

В реакционную систему вводят разЛичные количества супероксиддисмутазы Далее определяют концентрацию супероксиддисмутазы, при которой происходит образование диформазана, и по приведенной формуле рассчитывают количество кислородных радикалов, обра зуемых на субклеточном уровне. Пример. Фагоциты, полученные стандартно из брюшной полости мышей, инкубируют в HEPES - забуференной среде,, содержащей, 140 мМ NaCl, 5 мМ КС1, 20 мМ HgPES (рН 7,2), 5 мМ глюкозы, 223 мкМ тетранитросине го тетразолия. В качестве фагоцитиру мого материала, используют опсонизированные кроличьей антисьшороткой дрожжевые клетки Candida albicans. Время инкубации 30 мин при и постоянном встряхивании. Для количественного определения кислородных радикалов на субклеточном уровре строят калибровочную кривую. В HEPS-забуференную среду вносят ксантин (2-10 М) и различные количества ксантиноксидазы, что приводит к регистрируемым спектрофотометрически различным скоростям образования супероксидных анионов. Для каждой из скоростей образования экспериментально определяют различные величины их ингибирования определенньми количествами супероксиддисмутазы, после чего математически рассчитывают те количества супероксиддисмутазы, которые вызьгеают для каждого уровня образования супероксидт ных анионов максимальное ингибирова;ние восстановления тетранитросинего 1 704 Ьетразолия, детектируемое электронным микроскопом. В таком случае уравнение регрессии имеет следующий вид: У -0,267 + 0,242 X (,97)., где X - количество супероксиддисмутазы, мкг/мл, У - количество кислородных радикалов, ммоль/ми«. Вводя в среды инкубации, где содержатся фагоциты и фагоцитируемые частицы, различные количества сзшероксиддисмутазы, можно количественно определять кислородные радикалы на субклеточном уровне. Обработанные фагоциты полимеризуют в течение 48 ч при 60 С. Ультратонкие срезы получают на ультрампкротоме фирмы LKB (Швеция). Материал просматривают в электронном микроскопе Н-300 (Hitachi, Япония). Результаты, получаемые с помощью , предлагаемого способа отличаются высокой точностью, что подтверждается отсутствием неспецифических осадков, отсутствием различий в многочисленных сериях опытов и большим объемом проведенных экспериментальных исследований. Предлагаемьй способ позволяет более точно, на субклеточном уровне регистрировать образование кислородных радикалов, что необходимо для диагностики иммунодефицитных заболеваний. При этом расширяется область применения способа, поскольку описанные процедуры позволяют проводить исследования как в световом, так и в электронном микроскопе.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДНЫХ РАДИКАЛОВ, образуемых фагоцитами, включающий выделение клеток, смешивание их с фагоцитируемыми частицами, добавление соли тетразолия и инкубацию реакционной смеси с последуняцей регистрацией кислородных радикалов, отличающийся тем, что, с целью повышения его точности, в качестве контрастного вещества используют 150-250 мкМ тетранитросинего тетразолия, затем в ряд реакционных смесей дополнительно вводят супероксидцисмутазу от 1,1 мкг/мл до образования формазана, а количество кислородных радикалов (У) определяют по формуле (Л У -0,267 + 0,242Х, где X - количество супероксиддисмутазы, находящейся в пробе с образовавшимся формазансж, мкг/мл.