Реагент для индикации микроорганизмов Советский патент 1983 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/32 

05

со

00 00

сд Изобретение относится к микробиологии и медицине, в частности к реагентам для обнаружения микроорганизмов в жидкости. Известно средство обнаружения бактерий по редуктазной активности на основе реакции обеспечивания мети ленового синего в присутствии исследуемой пробы при 38-40 с. Регистрация наличия бактерий в пробе осуществляется визуально по обесцве чиванию окраски пробы l . Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является реагент для индикации микроорганизмов по дегидрогеназной активности, состоящий из носителя - бумаги, про питанной хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия и питательной средой. При использовании его смачивают ана лизируемой жидкостью и инкубируют в течение 12-14 ч. В случае наличия микроорганизмов возникает красное окрашивание 2 . Недостаток известного реагента длительное время анализа из-за необходимости подращивания микроорганизмов. Цель изобретения - уменьшение в мени, т.е. ускорение определения , микроорганизмов. Поставленная цель достигается тем, что реагент для индикации мик рборганизмов по их. дегидрогеназной активности на основе соли тетразоли содержит соль тетразолия в виде 2-9%-ного раствора в этиловом спирте и дополнительно содержит полизти ленгликоль, трехзамещенный фосфат калия и дистиллированную воДу при следующем соотнсшении компонентов, вес,ч.: Полиэтиленгликоль20-30Трехзамещенныйфосфат калия17-28 2-9%-ный раствор соли тетразолия в этиловом спирте 0,51-0,55 Дистиллированная водаОстальное Включенная в состав реагента (в виде спиртового раствора) соль тетразолия играет роль индикатора реак ции, осуществляемой дегидрогеназами микроорганизмов, по которой и судят об их наличии. Полиэтиленгликоль и трехзамещевный фосфат калия в ди тиллированной воде образуют двухфа ную систему, которая играет роль фона, на котором выявление микроорганизмов происходит особенно четко Бактерии, внесенные в систему, соби раются на границе раздела фаз, следовательно, их количество на поверхности раздела фаз увеличивается, что позволяет исключить из анализа такую длительную стадию, как подращивание, а это, в свою очередь, приводит к увеличению скорости взаимодействия бактерий с солями тетразолия и появления видимой окраски. Таким образом, экспрессность достигается за счет использования в индикаторе двухфазной системы. Кроме того, образующиеся при восстановлении солей тетразолия формазаны нерастворимы в воде и остаются на разделе фаз, где находится биоматериал, вследствии чего появляющаяся на границе раздела фаз окраска более контрастна и становится видной глазу наблюдателя раньше, чем при наблюдении того же явления в объеме жидкости. При увеличении объема пробы соответственно в 10 и 100 раз увеличивается чувствительность и соответственно уменьшается время анализа данной конкретной концентрации микроорганизмов за счет использования в качестве носителя концентрирующей двухфазной системы. При изготовлении предлагаемого реагента для введения соли тетразолия в систему ее растворяют в этиловом спирте, так как соли тетразолия плохо растворяются в воде. При этом на 0,01-0,05 вес.-ч. соли беру г 0,5 вес.ч. спирта, получая в результате 2-9%-ный спиртовой раствор. Данные количества являются необходимы ии для обеспечения стабильности двухфазной система реагента, проявления четкого окрашивания. Оптимальные значения рН, при которых используется предлагаемый реагент, составляют 6,2-7,0. Этот реагент обеспечивает индикацию микроорганизмов в течение 1-200 мин, т.е. значительно быстрееучем известный, используемый для этой цели. Экспрессность достигается за счет концентрирования микроорганизмов в интерфазе из объема жидкости и соответственно увеличения скорости появления окраски за счет большего удельного количества микроорганизмов. Использование в индикаторе в качестве носителя концентрирующей двухфазной системы позволяет исключить длительную стадию подращивания микроорганизмов. Пример.В пробирку на 25 мл сечением 1 см к 62,79 вес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую, вес,ч.: полиэтилеиглйколь ЗбО . 20; трех замещенный фосфат калия 17; иоднитротетразолий 0,01, растворенный в 0,5 вес.ч. этилового спирта. Систему подкисляют фосфорной кислотой до рН 6,8. После разделения фаз (1-1,5 мин) через 190 мин (в зависимости от вида и кон центрации микроорганизмов в пробе) наблюдают за окраской в интерфазе. Наличие, окраски указывает на присутствие микроорганизмов. Пример2. В пробирку по примеру 1 к 52,47 вес.ч. исследуе1уюй водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую вес.ч.: полиэтиленгликоль -400 25J трехзамещенный фосфат калия 22 иоднитротетразолий 0,003, растворенный в 0,5 вес,ч. этилового спирта, подкисляют систему фосфорнойкислотой до рН 6,8. После отстаивания (1-1,5 мин) через 0,2-40 мин (в зависимости от вида и концентрации микpoopVaниз мов в пробе) наблюдают за окраской в интерфазе. Наличие окраски ука- , зывает на присутствие микроорганизмов . ПримерЗ. В пробирку по при меру 1 к 41,45 вес.ч исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую, вес.ч. полиэтилеягликоль - 400 30, трехзамещенный фосфат калия 28; иоднитротетразолий 0,05, растворенный в 0,5 вес.ч. этилового спирта, подкисляют систему фосфорной кислотой до рН 6,8. После разделения фаз (1-1,5 мин) через 0,6-60 мин (в зависимости от вида и концентрации ми роорганизмов в npo6ej наблюдают за окраской в интерфазе. Наличие окрас ки указывает на присутствие ми.кро-. организмов. В табл. 1-3 дано время появления аналитического эффекта при определе нии иоднитротетразолий редуцирующей активности для аэробных микроорганизмов в зависимости от их вида и Концентрации в пробе (соответственн по примерам 1-3). Из табл. 1-3 следует, что исполь зование в индикаторе в качестве носителя концентрирующих двухфазных систем в сочетании с реагентом иоднитротетразолием позволяет прово дить определение аэробных микроорга низмов в пробе в зависимости от их вида и концентрации за 0,2-90 мин, I - Пример4.В пробирку по при меру 1 к 62,49 вес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, д бавляют смесь, содержащую вес.ч.; П лиэтиленгликоль - 400 20 трехзамещенный фос4)ат калия 17; тет разолий фиолетовый 0,01, растворенн в 0,5 вес.ч. этилового спирта, подкисляют систему ({Лэсфорной кислотой до рН 7. После разделения фаз ( 11,5 мин) через 20-70 мин (в зависимости от вида и концентрации микроорганизмов в пробе наблюдают-за окраской в интерфазе. Наличие окраски указывает на присутствие микроорганизмов. Пример 5. В пробирку по примеру 1 к 52,47 вес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид,аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую, вес.ч.: полиэтиленгликоль-400 25; трехзамещенный фосфат калия 22; тетразолий фиолетовый 0,03, растворенный в 0,05 вес.ч. этилового спирта, подкис ляют систему фосфорной кислотой до рН 7. После отстаивания через 550 мин (в зависимости от вида и кон.центрации микроорганизмов в пробе наблюдают за окраской в интерфазе. Наличие окраски указывает на присутствие микроорганизмов.. Примерб. В пробирку по примеру 1 к 41,45 вес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую вес.ч.: полиэтиленгликоль-400 30; трехзамещенный фосфат калия 28, тетразолий фиолетовый - 0,05, растворенный в 0,5 вес.ч. этилового спирта, подкисляют систему фосфорной кислотой до рН 7. После разделения фаз (l1,5 мин через 15-60 мин (в зависимости от вида и концентрации микроорганизмов в пробе} наблюдают за окраской в интерфазе. Наличие окраски указывает на присутствие микроорганизмов. В табл. 4-6 по примерам 4-6 соответственно дано время появления аналитического эффекта при определении редуцирующей активности тетразолий фиолетового для аэробных микроорганизмов в зависимости от их вида.и концентрации в пробе. Как видно из табл. 4-6, использование в индикаторе в качестве носителя концентрирующих двухфазных систем в сочетании с реагентом тетразолием фиолетовым позволяет проводить определение аэробных микроорганизмов в пробе в зависимости от их вида и концентрации за 5-9,0 мин. Пример7. В пробирку по примеру 1 к 62,49 вес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую, вес.ч.: полиэтиленгликоль-400 20; трехзамещенный фосфат калия 17/ неотетразолий хлорид 0,01, растворенный в 0,5 вес.ч. этилового спирта, подкисляют систему фосфорной кислотой до рН 6,2. После разделения фаз (1-1,5 мин) через 5-200 мин (в зависимости от вида и концентрации ми роорганизмов в пробе) наблюдают за окраской в интерфазе. Наличие окрас ки указывает на присутствие микроорганизмов . Примере. В пробирку по примеру 1 к 52,47 вес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей опреде ленный вид аэробных микроорганизмов добавляют смесь, содержащую вес-;ч.: полиэтиленгликоль-400 25; трехзамещенный фосфат калия 22у неотетразоп ЛИЙ хлорид 0,03, растворенный в 0,5 вес.ч. этилового спирта, подкисляют систему фосфорной кислотой до рН 6,2. После отстаивания через 2-120 мин (в зависимости от вида и концентрации микроорганизмов в пробе) наблюдают за окраской в интерфа зе. Наличие окраски указывает на присутствие микроорганизмов. Пример9. В пробирку по при .меру 1 к 41,45 вес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь содержащую вес.ч.: полиэтиленгликоль-400 30; трехзамещенный фосфат калия 28J неотетразолий хлорид 0,05, ра.створенный в 0,5 вес.ч. этилового спирта, подкис ляют систему фосфорной кислотой до рН 6,2. После разделения фаз (11,5 мин) через 4-180 мин (в зависимости от вида и концентрации микро организмов в пробе) наблюдают за окраской в интерфазе. Наличие окрас ки указывает на присутствие микроорганизмов. В табл. 7-9 показано время появления аналитического эффекта при определении редуцирующей активности неотетразолия хлорида для аэробных микроорганизмов в зависимости от их вида и концентрации в пробе (соответственно по примерам 7-9J. Из табл. 7-9 следует, что использование в индикаторе в качестве носителя концентрирующих двухфазных систем в сочетании с реагентом неотетразолием хлоридом позволяет проводить определение аэробных микроорганизмов в пробе в зависимости от их вида и концентрации за 2-200 мин. Предложенный индикатор позволяет сократить время проведения анализа на присутствие аэробных микроорганизмов в водной пробе до 0,2-200 мин (табл.1-2) по сравнению с прототипом (720-840 мин) за счет использования в индикаторе в качестве носителя концентрирукмцей двухфазной системы, что, в свою очередь, исключает длительную стадию подращивания микроорганизмов. Индикатор не требует дальнейшей разработки и может быть применен в микробиологическом производстве, а также для анализа воды на загрязненность микроорганизмами, внедрение его не требует больших затрат и специального обучения. Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в ускорении определения микроорганизмов. Таблица

РЕАГЕНТ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ПО ИХ дёгидрогеназной активности на основе соли тетразо лий,. отличающийся тем, что, с целью ускорения определения, он содержит соль тетразолия в виде- 2-9%-ного раствора в этиловом спирте и дополнительно содержит полиэтиленгликоль, трехзамещенный фосфат калия и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов вес.ч.: Полиэтиленгликоль20-30 Трехзамещенный фосфаткалия 17-28 2-9%-ный раствор i соли тетразолия в сл этиловом 0,51-0,55 спирте Дистиллированная Остальное вода

Е. coli М17

29

Sar. flava

,01

6,8

1

1-10

.1 -101-3

IlO

30 0,3

1 lO

1 -101-2

1 --lO

15

Вас, cereus

Вас. thuringiensis

E.coli М17

Sar. flava

Sacch.ce-revj. siae

Продолжение табл. 1

1-10

и

2 1-10

15 5 Ю

бО 8-10

2 8-10

б 8 «10

90

Таблица2

1-10

0,2

0,03 6,8 1 -10 1 10 .

1 -IC

1 -10

0,3 0,5

IlO

1 -10 5

1 -10

0,6

. 25 22 Вас, сегЁиз , thuringiensis

. coli M17

30

Sar. flava

Sacch. cerevisiae

30

. 10

1063835 Продолжение табл. 2

ТаблицаЗ

,05 .6,8

0,6

1-10

1-2

IlO 20

1-10

0,3

1-10

1 10

4

1 -10

1 -lO

1

1 -lO

4 15

6,8

,05 1-1052 0,03 6,8 1 - 5. ,5 810 40

Вас. cereus

Продолжение табл. j,

1 10

20

E.coli М17

25

Sar. flava

Sacch cerevisi. яе

25

Вас. cereus

Продолжение табл. 4

ТаблицаЗ

0,03

22 0,03

E.coii М17

30

Sar ..f iava

Sacch cerevisiae

30

Вас. cereus

Вас. thuringiensis

Продолжение табл. 5

8-10

40

Таблицаб

0,05

28- 0,05

Таблица

остав двухфазной системы

Вид микроорганизмов

Концентрация, вес.ч.

олиэтие нглиоля-400

E.ooli Ml7

30

Sar.flava

Продолжение табл. 8

ТаблицаЭ

КонценКонценВремя потрациятрация явления

РН неотетвизуальмикроорразолияно наблюганизмов , кл/мл даемой хлорида,

трехзамевес.ч. окраски щён но го мин фосфата калия

0,05

6,2

1-10

I-IO

IlO

1-10°

ii

100 1 -10 100 1 -Ю 100

Вас о cereus

Вас. thuringiensis

Продолжение табл.9

1 -10

180

1-10 180 .4

1-10

180

8-10° 180 8 10 180 8-10 180