Способ определения активности ингибиторов трипсина в плазме крови Советский патент 1990 года по МПК G01N33/68 

(Л

с

Изобретение относится к медицине, в частности к способам определения активности ингибиторов трипсина в плазме крови. Определение активности ингибиторов трипсина проводят в присутствии фермента, субстрата и плазмы, разведенной в 10 и 30 раз, а об истинной активности ингибиторов в неразведенной биологической жидкости судят по формуле X = K(A₂-A₁+A₁C₂-A₂C₁):(C₂-C₁), где X - активность ингибиторов протеолитического фермента

C₁ - минимальное разведение

C₂ - максимальное разведение

A₁ - степень торможения протеолиза при минимальном разведении

A₂ - степень торможения протеолиза при максимальном разведении

K - коэффициент пропорциональности.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для исследования активности ингибиторов протеолитических ферментов в биологических жидкостях при различных заболеваниях.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Из исследуемой биологической жидкости готовят два разведения Ё 10 и в 30 раз, в каждом из них определяют антиферментнуо активность и расчитывают активности ингибиторов, соответствующую неразведенному образцу плазмы.

П р и м е р 1. У практически здоровой женщины 24 лет натощак взята , венозная кровь в количестве 9,0 мл в пробирку, содержащую 1,0 мл 3,8%- ного раствора цитрата натрия. Плазма,

получена путем центрифугирования этой пробирки при 3000 об/мин в течение 10 мин (известные условия, используемые в биохимических исследованиях) . Плазму разводили в 10 и в 30 раз 0,05 М трис-HCl буфером с рН 8,02, содержащим k М хлорида кальция (буфер, используемый для определения активности трипсина и его ингибиторов в известных способах). Для этого в две пробирки наливали по 0,1 мл плазмы, по 0,9 мл (для разведения в 10 раз) и 2,9 мл (для разведения в 30 раз) буфера. Из каждой пробирки отбирали по 0,2 мл раствора соответственно разведенной плазмы и вносили в две пробирки, содержащие по 0,2 мл раствора трипсина 7 мкг/мл, приготовленного на том же буфере, и 0,6 мл буфера. Все проелsj

со

Јь

СО

3 15

бирки инкубировали 10 мин при 20, за тем добавляли 1,0 мл раствора казеина по Гаммарстену, приготовленного на том же буфере, и инкубировали 20 мин при 37°С. В пробирки добавляли 3,0 мл 5Ј-ного раствора трихлоруксусной кислоты, фильтровали через бумажный фильтр синяя лента и определяли оптическую плотность против контроля, в который вместо трипсина добавляли 0,2 мл буфера, а трипсин вносили после остановки реакции (после добавления трихлоруксусной кислоты) на спектрофотометре СФ-46 при 280 нм в кю- вете 1 см.

Отдельно ставили пробу на активность фермента (контроль): в пробирку наливали 0,2 мл раствора Трипсина мкг/мл, 0,8 мл буфера и 1,0 мл 1%-ного раствора казеина. Инкубировали 20 мин при 37°С, добавляли 3,0 мл 5%-ной трихлоруксусной кислоты, фильтровали через бумажный фильтр синяя

лента и определяли оптическую плотность против дистиллированной воды.

Степень торможения протеолиза при различных разведениях определяли по формуле:

А

Е(1 - ) SJL.

V где Е

В

-количество фермента в пробе;

-количество гидролизованного субстрата В присутствии исследуемого образца (соответствует приросту оптической плотности в условиях опыта)

-количество гидролизованного субстрата без исследуемого образца (соответствует приросту оптической плотности в пробе на контроль активности фермента);

-разведение;

-объем исследуемого образца (разведенного) в пробе.

При разведении в 10 раз AJ 682. При разведении в 30 раз А2 1252.

Истинную активность ингибиторов трипсина в неразведенной плазме расчитывали по формуле

С

V

..

где X - истинная активность ингибиторов протеолитического фер55

0

5

0

5

0

5

0

5

мента Е неразведенном образце биологической жидкости; С - минимальное разведение (в

10 раз); С2 - максимальное разведение (в

30 раз);

. А - степень торможения протеолиза при минимальном разведении;

А2 - степень торможения протеолиза при максимальном разведении;

К - коэффициент пропорциональности, зависящий от характеристик использ-уемого фермента и субстрата (в данном случае К 0 1): X 1 423 мкг трипсина/мл.

П р и м е р 2. Определение проводилось также как и в примере 1, за исключением того, что плазму разводили 10-150 раз.

При разведениях больше 30 нарушается линейность зависимости степени торможения протеолиза от разведения. Это делает невозможным использование больших разведений, так как представленная формула для расчета позволяет определить активность ингибиторов в неразведенной биологической жидкости по результатам степени торможения протеолиза при различных разведениях только при наличии линейной зависимости степени торможения протеолиза от разведения.

Формула изобретения

Способ определения активности ингибиторов трипсина в плазме крови путем проведения протеолиза в присутствии разведенной- плазмы с последующим спектрофотометрическим измерением степени торможения протеолиза субстрата, отличаю-щийся тем, что, с целью повышения точности способа плазму разводят минимально в 10 и максимально в 30 раз, в каждом разведении определяют степень торможения протеолиза субстрата,а активность ингибиторов трипсина в неразведенной плазме определяют по формуле

v „ ГАг - А , + AiC 7 - АгС,

х J

где X - активность ингибиторов протеолитического фермента;

э1573 30б

С1 - минимальное разведение;лиза при максимальном разCj - максимальное разведение;ведении;

А, степень торможения протео- К - коэффициент пропорциональлиза при минимальном разве-ности, зависящий от харакдении;теристик используемых ферА2 степень торможения протео-мента и субстрата.