Способ определения активности протеолитических ферментов Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к энзимологии и может быть использовано для определения протеолитической активности ферментных препаратов в клинической биохимии.

Целью изобретение является повышение чувствительности и специфичности метода.

Способ осуществляют следующим образом.

Антитела против субстрата получают иммунизацией кроликов или дру-их животных или используют готовую сыдоротку. Белковый субстрат иммобилизуют на формалинизированных эритроцитах через тан- ниновую кислоту в дозе 100 мкг на 1 мл 5%-ной суспензии эритроцитов. Приготовленные эритроциты с субстратом, а также антитела сохраняют в холодильнике. Можно имобилизовать на тех же эритроцитах несколько разных белковых субстратов и затем определить специфичность фермента

по отношению к каждому субстрату отдельно на основе специфичных антител Ферментный препарат инкубируют с белковым субстратом, иммобилизованным на эритроцитах, в термостате при 37°С в течение 1 ч в 0,02 м трис-буфере рН 8,0. Формалини- зированные эритроциты предварительно отмывают от формалина физиологическим раствором (ФР).

Иммунохимический анализ осуществляют в 96-луночном планшете. Делают ряд двукратных разведений антисыворотки известного титра в нормальной кроличьей сыворотке или в забуференном ФР по 25 мкл в лунке. Во все лунки добавляют инкубированные с ферментом и отмытые от него ФР субстратные эритроциты (по 25 мкл 0,5%- ной суспензии в ФР, забуференном до рН 7,2). Агглютинацию учитывают через 1 ч визуально. Для каждой серии опытов параллельно устанавливают титр используемой

О

ы

ы ы

антисыворотки с данными субстратными эритроцитами. Более четкие результаты получают при выдерживании реакции ге- магглютинации еще 1 ч в холодильнике. При ферментативной деградации иммобилизи- рованного на эритроцитах субстрата снижается титр антисыворотки по сравнению с исходными (контроль) субстратными эритроцитами. Протеолотичекую активность исследуемого препарата оценивают по степени снижения титра антисыворотки (по укорочению агглютинационного ряда).

П р и м е р 1. Определение протеолити- ческой активности трипсина с иммобилизо- ванным фибронектином ц качестве субстрата.

В качестве субстрата используют фиб- ронектин-гликопротеид плазмы человека (коммерческий препарат Харьковского завода бактпрепаратов). Антисыворотку к фибронектину получают иммунизацией кролика. Использованный пул антисыворотки преципитируетс фибронектином в реакции Оухтерлони до титра 1:2000. Фибронектин иммобилизуют на формализированных эритроцитах через танниновую кислоту в дозе 100 мкг на 1 мл 5%-ной суспензии эритроцитов в течение 3 ч при 37°С. Приготовленные таким образом эритроциты с иммобилизованным фибронектином хранят при 4°С в концентрации 10%.

Трипсин в количестве 1 мг растворяют в 1 мл трис-HCI или борноборатного буфера с рН 8,0, или в воде и быстро делают ряд разведений трипсина в том же буфере до концентрации 1 нг. Во все разведения добавляют суспензию эритроцитов с иммобилизованным на них фибронектином. На 1 мл ферментного препарата добавляют 15,0мкл 10%-ной суспензии эритроцитарного субстрата. Инкубируют 1 ч при 37°С в термостате. Инкубированные образцы сразу же центрифугируют 5 мин при 3 тыс. об/мин и отмывают ФР от трипсина при повторном центрифугировании, ресуспендируют в ФР до концентрации 0,5% (300 мкл ФР добавляют к осадку эритроцитов).

Антисыворотку к фибронектину титруют в серии двухкратных разведений в объемах по 25 мкл. Для этого исходную сыворотку с тетром 1:250000 разбавляют в 10 раз (50 мкл антисыворотки разбавляют 0,5 мл забуфе- ренного ФР с рН 7,2 ), Во все лунки добавляют отмытый иммобилизованный субстрат, центрифугированный после реакции с ферментом в объеме 25 мкл, и оставляют на 1 ч при комнатной температуре и еще на 1 ч в холодильнике. Затем читают реакцию, отмечая последнюю лунку, где уже не идет реакция агглютинации эритроцитов. Это разведение и отражает активность фермента. Трипсин в концентрации 10 мг еще расщепляет фибронектин, предотвращая реакцию агглютинации в сравне- нии с контрольным рядом.

Специфичность определения подтверждается экспериментом, при котором инкубация фермента с субстратом в присутствии

соевого ингибитора полностью восстанавливает реакцию агглютинации по сравнению с той же концентрацией трипсина, где ферментативная реакция идет без ингибитора, Избыточное количество фермента (более 1 мг/мл) приводит к повреждению самих эритроцитов, и вследствие этого осуществляется реакция агглютинации, но по неспецифичному механизму.

Сравнение результатов, полученных

предлагаемым способом и по способу-прототипу, выявляет существенно большую чувствительность предлагаемого способа. Так, определение протеолитической активности с использованием реакции агглютинации

позволяет уловить активность взятого препарата трипсина при концентрации последнего 100 нг, в то же время как способ-прототип улавливает трипсин лишь в концентрации 50000 нг.

Таким образом, предлагаемый способ в 500 раз более чувствителен, чем способ- прототип.

Предлагаемый способ является микрометодом, так как для одного определения на 1 ряд разведений требуется 3 мкг субстрата (в 300 мкл 0,5%-ной суспензии эритроцитов) и 100 нг (300 мкл) ферментного препарата - трипсина. Метод универсален и специфичен, так как на эритроцитах можно иммобилизовать любой белок и даже несколько белковых субстратов одновременно.

Чувствительность метода и его специфичность увеличиваются благодаря применению антисыворотки к субстрату, а также за счет использования субстрата, иммобилизованного на твердом носителе, в данном случае на эритроцитах. Субстрат можно иммобилизовать также на латексныхили на

других подходящих частицах, Метод удобен при использовании дефицитных субстратов и при изучении высокоспецифичных ферментов, так как для постановки реакции и иммунизации требуется менее 1 мг белка.

Определение протеолитической активности предлагаемым способом не зависит от возможного процесса аутолиза во время инкубации и не зависит от гомогенности субстрата. Метод не требует дорогостоящего оббрудования и прост в выполнении.

Формула изобретениятах, затем после инкубирования с ферменСпособ определения активности проте-том эритроциты обрабатывают антителами

олитических ферментов, включающий инку-к субстрату и по снижению титров антител в

бирование субстрата с ферментом, о т л и -реакции агглютинации по сравнению с эрит

чающийся тем, что, с целью повышения5 роцитами, не обработанными ферментом,

чувствительности анализа, перед инкуба-определяют наличие активности протеолицией субстрат иммобилизуют на эритроци-тических ферментов,

Изобретение относится к энзимологии и может быть использовано для определения протеолитической активности ферментных препаратов в клинической биохимии. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Белковый субстрат иммобилизуют на формалинизированных эритроцитах. Затем инкубируют их с исследуемым ферментом при 36°С в течение 1 ч. В микропанелях разводят сыворотку против субстрата и добавляют обработанные ферментом эритроциты, инкубируют их Проте- олитическую активность оценивают до степени снижения титра антисыворотки. По сравнению с прототипом увеличивается чувствительность способа в 500 раз