СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРЕВАРИМОСТИ БЕЛКОВ Российский патент 1994 года по МПК C12Q1/00 C12Q1/37 G01N33/48 G01N33/50 G01N33/52 C12N9/50 

Изобретение относится к физико-химической биологии и биотехнологии, а именно к биологической химии, молекулярной биологии, биоорганичиеской химии, и может быть использовано научными учреждениями при изучении свойств белков и ферментов.

Известны методы определения переваримости белков, заключающиеся в воздействии протеолитических ферментов на соответствующие белки с последующим определением оставшегося белка в растворах (Axtell et al., 1981; Salgo et al., 1985, Kaczkowski et al., 1985; Bromel-Cox et al, 1990).

Однако основным недостатком данных методов является невозможность определения переваримости некоторых труднорастворимых в водных растворах белков типа проламинов и глютелинов зерна злаковых. Последние белки могут находиться в растворенном состоянии только при наличии мочевины, спиртов или детергентов. Однако последние соединения значительно снижают или полностью ингибируют активность протеолитических ферментов, и сведения о переваримости не могут быть получены либо будут искажены. Для устранения этого недостатка предложено тестируемую растительную массу помещать в пакет из фильтрованной бумаги с последующим выдерживанием в растворе фермента (Похиленко, 1985; Левицкий А.П., Похиленко Л.И., 1987). Данный способ, зарегистрированный как изобретение (авт.св. N 1247750) и выбранный в качестве прототипа, обладает рядом существенных недостатков. Во-первых, анализ довольно длителен, и только процедура ферментативной обработки занимает 15-24 ч. Во-вторых, с помощью данного способа невозможно определить переваримость водорастворимых белков. В-третьих, ферментативному гидролизу подвергаются все белки, которые имеются в зерне, и судить о переваримости отдельных белков не представляется возможным. В-четвертых, способом не предусмотрено изучение денатурированных белков.

Целью изобретения является ускорение диагностики и повышение эффективности при определении переваримости белков.

Это достигается тем, что анализируемые белки или их смесь наносят на фильтровальную бумагу, фиксируют (денатурируют) с помощью высокой температуры до или после ферментативной обработки, а затем на участки, содержащие белок, наносят раствор фермента и после инкубирования в течение требуемого времени (не более 2 ч) определяют оставшийся связанный белок.

Существенный признак прототипа, общий для него и заявляемого объекта исследования, обработка препаратов белков раcтвором фермента.

Предлагаемый cпоcоб отличаетcя от прототипа следующим:
анализируют как водорастворимые, так и нерастворимые в воде белки,
позволяет исследовать как нативные, так и денатурированные белки,
препараты белков наносят на фильтровальную бумагу,
расход белка оценивают по связыванию его с красителем.

П р и м е р 1. По 10 мг коммерческих белков человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) и ингибитора трипсина из сои растворяют отдельно в 2 мл дистиллированной воды. На полоски фильтровальной бумаги шириной 2-3 см наносят по 5 мкл каждого белка в восьмикратной повторности и помещают в термостат на 15 мин при температуре 110^оС. Затем полоски бумаги промывают в течение 5 мин в 5%-ном растворе уксусной кислоты, слегка подсушивают и наносят по 5 мкл 0,025%-ного раствора пепсина, приготовленного на 5%-ной уксусной кислоте, на четыре участка, содержащие белок (опытные образцы). Другие четыре участка с белком на фильтровальной бумаге оставляют для контроля. Полоски бумаги помещают над раствором 5%-ной уксусной кислоты в эксикатор на 2 ч при температуре 37^оС. Затем окрашивают на белок в течение 20 мин с помощью 1%-ного раствора амидочерного 10Б, приготовленного на смеси этанол - трихлоруксусная кислота - вода, взятых в соотношении 8:1:1. Избыток красителя удаляют промывкой 7%-ным раствором уксусной кислоты и высушивают бумагу под феном. Окрашенные кружки фильтровальной бумаги с белком, обработанные пепсином, и контрольные образцы вырезают и помещают в пробирки, содержащие по 2 мл 0,1 М раствора NаОН и экстрагируют краситель при встряхивании в течение 1 ч. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряют на спектрофотометре при длине волны 620 нм, и содержание белка в каждом образце рассчитывают по калибровочной кривой, построенной на различных разведениях ЧСА (от 5 до 50 мкг белка на 5 мкл раствора). Для определения переваримости находят среднее содержание из четырех параллельных контрольного образца ЧСА, равное 14,84 мкг белка. Из полученного значения вычитают среднее содержание четырех параллельных опытного образца, подвергавшегося действию пепсина и равное 4,87 мкг белка. Полученную разницу (9,97 мкг) делят на значение контрольного образца и умножают на 100%. Переваримость ЧСА пепсином равна 67,2% . Аналогичным образом находят переваримость ингибитора трипсина из сои, которая равна 53,2%. В общем виде расчет переваримости можно представить в виде следующей формулы:
100% , где А_контр и А_опыт - содержание белка в контрольных и опытных образцах.

П р и м е р 2. Зерна кукурузы и сорго (у кукурузы предварительно удаляют зародыш) размалывают до тонкого порошка, отвешивают по 600 мг каждого образца в центрифужные пробирки, приливают по 1,2 мл 1 М раствора NaCl и ставят в холодильник на 1 ч с периодическим перемешиванием каждые 15 мин. Затем центрифугируют при 7000 g в течение 15 мин. Раствор, содержащий альбумины и глобулины собирают и операцию по извлечению этих белков повторяют еще три раза. Затем осадок муки промывают 5 мл дистиллированной воды два раза для удаления соли и после центрифугирования приливают по 1,2 л 65%-ного или 70%-ного изопропанола для кукурузы или сорго соответственно. После перемешивания пробирки закрывают пробками и ставят на водяную баню на 1 ч при температуре 60^оС. Центрифугируют при 7000g в течение 15 мин и собирают раствор проламинов. Затем операцию по извлечению данных белков повторяют еще три раза. После этого к осадку муки приливают 5 мл дистиллированной воды, перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость отбра- сывают, а осадок заливают 1,2 мл 0,1 М раствора NaOH и экстрагируют глютелины в течение 1 ч при комнатной температуре, перемешивая каждые 15 мин. Центрифугируют при 7000g в течение 15 мин и надосадочную жидкость собирают.

Выделенные фракции белков наносят на полоски фильтровальной бумаги по 5 мкл в восьмикратной повторности. Дальнейшая процедура по определению переваримости белков с помощью пепсина совпадает с описанной в примере 1. Отношение фермент : субстрат 1 : 20. Переваримость белков из зерна кукурузы и сорго представлена в табл.1.

П р и ме р 3. Белки (альбумины - глобулины, проламины, глютелины) из зерен кукурузы и сорго выделяют, как описано в примере 2. Затем белки наносят по 5 мкл на фильтровальную бумагу в восьмикратной повторности и помещают в термостат на 15 мин при температуре 110^оС. После этого полоски бумаги выдерживают в течение 5 мин в 0,2 М растворе уксуснокислого натрия, доведенного до рН 6,5 с помощью уксусной кислоты, слегка подсушивают и наносят по 3-6 мкл 0,025%-ного раствора папаина, приготовленного на 0,2 М растворе уксуснокислого натрия и содержащего 1% 3-меркапто-1,2-пропандиола на четыре участка с белком (опытные образцы, соотношение фермент : субстрат 1 : 20). Другие четыре участка с белками на фильтровальной бумаге оставляют для контроля. Полоски бумаги помещают над 0,2 М раствором уксуснокислого натрия рН 6,5 в эксикатор на 2 ч при температуре 37^оС. Дальнейшая процедура по окрашиванию белков красителем и определению переваримости совпадает с описанной в примере 1. Данные о перева- римости белковых фракций зерна с помощью папаина представлены в табл.1.

П р и м е р 4. Белки (альбумины-глобулины, проламины и глютелины) выделяют, как описано в примере 2. Затем белки наносят на фильтровальную бумагу по 5 мкл в восьмикратной повторности, слегка подсушивают и на каждый участок добавляют по 10-15 мкл 5%-ного раствора уксусной кислоты. Затем на четыре опытных участка, содержащих белок, капают по 5-10 мкл 0,025%-ного раствора пепсина, приготовленного на 5%-ной уксусной кислоте (соотношение фермент : субстрат 1 : 20), а другие четыре участка оставляют для контроля. Полоски фильтровальной бумаги помещают над раствором 5%-ной уксусной кислоты в эксикатор на 2 ч при температуре 37^оС. Затем выдерживают в термостате в течение 15 мин при 110^оС и определяют содержание белка в пробах с помощью амидочерного 10 Б, как описано в примере 1. Данные по переваримости неденатурированных белков представлены в табл.2.

П р и м е р 5. Белки выделяют и наносят на фильтровальную бумагу, как описано в примере 2. Бумагу слегка подсушивают и на каждый участок, содержащий белок, наносят по 10-15 мкл 0,2 М раствора уксуснокислого натрия, рН 6,5. Затем на четыре участка (опытные образцы) добавляют по 5-10 мкл 0,025% -ного раствора папаина, приготовленного на буфере, состав которого описан в примере 3 (соотношение фермент : субстрат 1 : 20), а четыре другие участка оставляют для контроля. Полоски фильтро- вальной бумаги помещают над 0,2 М раствором уксуснокислого натрия, рН 6,5 в эксикатор на 2 ч при температуре 37^оС. Дальнейшая процедура совпадает с описанной в примере 4. Данные по переваримости неденатурированных белков представлены в табл.2.

Использование предлагаемого способа определения переваримости белков по сравнению с известным имеет следующие преимущества:
сокращает время анализа в 2-3 раза и более;
позволяет определять переваримость индивидуальных белков, как водорастворимых, так и не растворимых в водных растворах;
дает возможность проводить сравнительный анализ переваримости денатурированных белков и белков в нативном состоянии;
можно определять переваримость микрограммовых количеств белка.

Использование: пищевая промышленность, медицинская биохимия, энзимология, сельское хозяйство. Сущность изобретения: исследуемый препарат белка наносят на полоску из фильтровальной бумаги в нескольких повторностях, часть проб обрабатывают протеолитическим ферментом (пепсин, папаин), а другую часть оставляют в качестве контроля; после инкубации все пробы окрашивают амидочерным 10Б, затем комплекс белка с красителем элюируют, определяют содержание белка в полученных окрашенных растворах спектрофотометрическим методом и оценивают переваримость образца как долю гидролизованного белка, выраженную в процентах от исходного количества. 2 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРЕВАРИМОСТИ БЕЛКОВ, включающий обработку препаратов белка, нанесенных на матрицу из фильтровальной бумаги, протеолитическим ферментом и оценку эффективности протеолиза по убыли субстрата в зоне реакции, отличающийся тем, что опытные и необработанные ферментом контрольные пробы после завершения инкубации окрашивают, затем краситель элюируют, определяют оптическую плотность полученных растворов и содержание в них белка, а переваримость белка рассчитывают по формуле
100%
где A_о и A_к - содержание белка соответственно в опытных и контрольных пробах.