Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к искусственному осеменению животных.
Цель изобретения - повышение производительности и точности способа.
Пример. Количество живых спер- мий определяют следующим образом.
1.Интенсивность флуоресценции , (F0), растворенного в буферном растворе йодистого пропидия (PJ), измеряют на 1600 мл раствора красителя с Концентрацией 25 мг/л, эта величина служит одновременно стандартом.
2.В раствор добавляют предварительно разбавленную в 40 л буферного раствора пробу спермы и снова измеряют интенсивность(F,).
3.Затем добавляют к пробе в качестве реактива проницаемости 46 мл. спиртового раствора дигитонина с кон-.
центрацией 5 мг/мл9 снова измеряют интенсивность (F2).
4.Изготовляют параллельную исходную смесь без пробы спермы: 1600 мл раствора йодистого пропидия, 40 мл фосфатного буферного раствора PBS (phosphate buffer saline) и 40 мл спиртового раствора дигитонина. Измеряют интенсивность флуоресценции этой пробы РЗ.
5.Измеряют интенсивность 1600 мл буферного раствора (F).
6.Добавляют к буферному раствору 40 мл предварительного разбавленной спермы, снова измеряют интенсивность Ff).
На основании измеренных интенсив- ностей можно вычислить процент живых семенных клеток следующим o6pasoMj
ел i сд
со со
с
живые клетки (%) 100 .
Ft-F3)-(F2-F4) 10UОбщее число спермий можно определить из одинаковых величин интенсивности s так как разность между F, и F- величина (FX-F3) образуется от всех имеющих проницаемость клеток о Величина (FS-F3) показывает в области 1х103 1,5x10 клеток/см3 линейную зависимость от концентрации клеток В этой |эбласти из величины Б 2-F3 можно опре- елять при помощи калибровочной кри- Јой число клеток в пробе
И в этом случае следует принимать 9 расчет неспецифическое вызванное 4пермиЕми повышение интенсивности (F5-F4).
Концентрация спермий ч миллионь5/мчэ / (Fi-F3)-(Fir-F4) .
, 0(. где „/„ КОЭффИцх1 О
ант5 полученный умножением тангенса крутизны калибровочной кривой на степень предварительного разбавления спермы.
Калибровочная кривая может сниматься в цитометре потока на маркированных йодистым пропидием пообах спермм Следующим образом.
Исследуемую суспензию клеток разбавляют буферным раствором PBS до Концентрации 035 2х106 клеток/мл , 1 мл этой суспензии охлаждают во гтьду и разбавляют 1 мл 1%-ного раствооа NP- 40 (раствор Нокидет Р--40; изготовитель; Сигма Хеми ГмбХ, Дайзенхофен, ФРГ) В результате обработки убивают
все клетки, их клеточные оболочки становятся проницаемыми для йодистого пропидия
Затем добавляют к пробе такое количество растворенного в буферном растворе PBS йодистого пропидияэ чтобы конечная концентрация составляла 30 Mr/мл,
Окрашенную пробу анализируют в цитометре потока например в цигометре Бектона-Дикансона типа FACS III, со скоростью потока 1500 клеток/с. Возбуждение происходит при помощи арго- иионного лазера при длине волны 488 нм5 амиссию регистрируют з области длины волны выше 620 нм при промежуточном включении проницаемого вверх режущего фильтра.
Во время анализа протекающие миме клетки считает прибор на основании
г
0
5
интенсивности флуоресценции, а так как клетки благодаря обработке все становились проницаемыми и все поглощали краситель, подсчитанное число соответствует абсолютному числу клеток Точным определением израсходованного количества пробы, учитывая коэффициент разбавления, получают первоначальную концентрацию клеток пробы с Эта концентрация должна соответствовать величине, измеренной на гпектрофлуориметре для одинаковой пробы
(),
FC
Из пробы изготовляют рзд разбавлений и в результате серии дитометричес- ких и спектрофлуориметрических измерений в различных областях концентраций определяют абсолютные количества клеток э принадлежащие к измеренным на спектрофлуориметре коэффициентам интенсивности Точность этих величин гарантируется многократно повторенными измерениями. Так как величина коэффициента интенсивности изменяется линейно с изменением концентрации клеток,, можно для каждого исследованного вида спермы построить прямуюs на основании которой можно определить принадлежащие к измеренным коэффициентам интенсивности количества клеток о
Умножением тангенса крутизны (тангенса угла наклона) калибровочной кривой на степень разбавления пробы спермы получают коэффициент d. Последний, умноженный на измеренный коэффициент интенсивности; дает непосредственно концентрацию клеток пробьь
Формула изобретения
Способ быстрого определения числа спермиев в пробе, включающий обработку клеток веществом,; придающим проницаемость оболочке клетки, и раствором флуоресцентного красителя в буфере с последующей регистрацией флуоресценции и определением числа клеток в пробе5 отличающийся тем, чтоз с целью увеличения производительности и точности способа, в качестве флуоресцентного красителя используют йодистый пропидий, в качестве вещества, придающего проницаемость оболочке клеткиэ - сапонин или диги- тонин5 или нигтзтинэ обработку клеток
5 1575931
ведут вначале йодистым пропидием, арацию С спермы определяют из соотнозатем сапонином или дигитониномэ илишения
нистатином, регистрацию флуоресцен-г /(Fz-F 3)-(Fj-F4) ..„лл.3
« МЛН/ММ ,
ции проводят на-фотоэлектронной уста-, te
новке, причем отдельно измеряют флуо-где с( коэффициент, полученный умноресценцию буферного раствора йодисто-жением тангенса крутизны каго пропидия (F0), буферного растворалибровочной кривой на степень
йодистого пропидия и спермы (Fj, бу-предварительного разбавления
ферного раствора йодистого пропидия,Ю спермы,
спермы и сапонина (Рг)э буферного ра-а количество М живых клеток - из соствора йодистого пропидия и сапонинаотношения
(F3), буферного раствора (F4), буфер-М 100- --1-- --- -Ј::----100%.
кого раствора и спермы (F5), концент-(FZ-F S)-(F5--F4)
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Способ контактирования жидкостей и газов | 1987 |
|
SU1732812A3 |
Энергосберегающая система обогревания и/или охлаждения сооружения, имеющего по меньшей мере два изолированных между собой помещения | 1986 |
|
SU1473722A3 |
Способ получения производных сложных эфиров карбаминовой кислоты | 1987 |
|
SU1590040A3 |
Способ регулирования половой деятельности млекопитающих | 1986 |
|
SU1837888A3 |
СПОСОБ ЛИПОСОМАЛЬНОГО ИММУНОАНАЛИЗА ДЛЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ АНАЛИТОВ В ОБРАЗЦЕ | 2001 |
|
RU2203495C2 |
Способ определения жизнеспособности сперматозоидов человека | 2018 |
|
RU2689791C1 |
Способ определения липополисахаридных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови | 1990 |
|
SU1720003A1 |
Способ определения содержания белка в дрожжевых клетках | 1990 |
|
SU1725121A1 |
АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ СОСТАВЫ ДЛЯ ХИМЕРНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ TNFR:FC | 2014 |
|
RU2663727C2 |
СПОСОБ ПОРОФОРМИРОВАНИЯ В МЕМБРАНАХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ С ПОМОЩЬЮ ОБРАБОТКИ ИХ ГЕМОЛИЗИНОМ II Bacillus cereus | 2012 |
|
RU2504389C2 |
Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к искусственному осеменению животных. Целью изобретения является повышение производительности и точности способа. Пробу спермы обрабатывают йодистым пропидием, затем дигитонином или сапонином или нистатином, проводя регистрацию флуоресценции на флуориметре. Концентрацию C спермы определяют из соотношения C=Α.(F2-F3)-(F5-F4)/F0 млн/мм3, где F0 - флуоресценция буферного раствора йодистого пропидия
F2 - то же, спермы и сапонина
F3 - то же, буферного раствора йодистого пропидия и сапонина
F4 - то же, буферного раствора
F5 - то же, буферного раствора и спермы
α - коэффициент, полученный умножением тангенса крутизны калибровочной кривой на степень предварительного разбавления спермы.
Авторское свидетельство СССР № 1336557, кл | |||
Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
Авторы
Даты
1990-06-30—Публикация
1988-03-16—Подача