Способ быстрого определения числа спермиев в пробе Советский патент 1990 года по МПК A61D19/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к искусственному осеменению животных.

Цель изобретения - повышение производительности и точности способа.

Пример. Количество живых спер- мий определяют следующим образом.

1.Интенсивность флуоресценции , (F0), растворенного в буферном растворе йодистого пропидия (PJ), измеряют на 1600 мл раствора красителя с Концентрацией 25 мг/л, эта величина служит одновременно стандартом.

2.В раствор добавляют предварительно разбавленную в 40 л буферного раствора пробу спермы и снова измеряют интенсивность(F,).

3.Затем добавляют к пробе в качестве реактива проницаемости 46 мл. спиртового раствора дигитонина с кон-.

центрацией 5 мг/мл9 снова измеряют интенсивность (F2).

4.Изготовляют параллельную исходную смесь без пробы спермы: 1600 мл раствора йодистого пропидия, 40 мл фосфатного буферного раствора PBS (phosphate buffer saline) и 40 мл спиртового раствора дигитонина. Измеряют интенсивность флуоресценции этой пробы РЗ.

5.Измеряют интенсивность 1600 мл буферного раствора (F).

6.Добавляют к буферному раствору 40 мл предварительного разбавленной спермы, снова измеряют интенсивность Ff).

На основании измеренных интенсив- ностей можно вычислить процент живых семенных клеток следующим o6pasoMj

ел i сд

со со

с

живые клетки (%) 100 .

Ft-F3)-(F2-F4) 10UОбщее число спермий можно определить из одинаковых величин интенсивности s так как разность между F, и F- величина (FX-F3) образуется от всех имеющих проницаемость клеток о Величина (FS-F3) показывает в области 1х103 1,5x10 клеток/см3 линейную зависимость от концентрации клеток В этой |эбласти из величины Б 2-F3 можно опре- елять при помощи калибровочной кри- Јой число клеток в пробе

И в этом случае следует принимать 9 расчет неспецифическое вызванное 4пермиЕми повышение интенсивности (F5-F4).

Концентрация спермий ч миллионь5/мчэ / (Fi-F3)-(Fir-F4) .

, 0(. где „/„ КОЭффИцх1 О

ант5 полученный умножением тангенса крутизны калибровочной кривой на степень предварительного разбавления спермы.

Калибровочная кривая может сниматься в цитометре потока на маркированных йодистым пропидием пообах спермм Следующим образом.

Исследуемую суспензию клеток разбавляют буферным раствором PBS до Концентрации 035 2х106 клеток/мл , 1 мл этой суспензии охлаждают во гтьду и разбавляют 1 мл 1%-ного раствооа NP- 40 (раствор Нокидет Р--40; изготовитель; Сигма Хеми ГмбХ, Дайзенхофен, ФРГ) В результате обработки убивают

все клетки, их клеточные оболочки становятся проницаемыми для йодистого пропидия

Затем добавляют к пробе такое количество растворенного в буферном растворе PBS йодистого пропидияэ чтобы конечная концентрация составляла 30 Mr/мл,

Окрашенную пробу анализируют в цитометре потока например в цигометре Бектона-Дикансона типа FACS III, со скоростью потока 1500 клеток/с. Возбуждение происходит при помощи арго- иионного лазера при длине волны 488 нм5 амиссию регистрируют з области длины волны выше 620 нм при промежуточном включении проницаемого вверх режущего фильтра.

Во время анализа протекающие миме клетки считает прибор на основании

г

0

5

интенсивности флуоресценции, а так как клетки благодаря обработке все становились проницаемыми и все поглощали краситель, подсчитанное число соответствует абсолютному числу клеток Точным определением израсходованного количества пробы, учитывая коэффициент разбавления, получают первоначальную концентрацию клеток пробы с Эта концентрация должна соответствовать величине, измеренной на гпектрофлуориметре для одинаковой пробы

(),

FC

Из пробы изготовляют рзд разбавлений и в результате серии дитометричес- ких и спектрофлуориметрических измерений в различных областях концентраций определяют абсолютные количества клеток э принадлежащие к измеренным на спектрофлуориметре коэффициентам интенсивности Точность этих величин гарантируется многократно повторенными измерениями. Так как величина коэффициента интенсивности изменяется линейно с изменением концентрации клеток,, можно для каждого исследованного вида спермы построить прямуюs на основании которой можно определить принадлежащие к измеренным коэффициентам интенсивности количества клеток о

Умножением тангенса крутизны (тангенса угла наклона) калибровочной кривой на степень разбавления пробы спермы получают коэффициент d. Последний, умноженный на измеренный коэффициент интенсивности; дает непосредственно концентрацию клеток пробьь

Формула изобретения

Способ быстрого определения числа спермиев в пробе, включающий обработку клеток веществом,; придающим проницаемость оболочке клетки, и раствором флуоресцентного красителя в буфере с последующей регистрацией флуоресценции и определением числа клеток в пробе5 отличающийся тем, чтоз с целью увеличения производительности и точности способа, в качестве флуоресцентного красителя используют йодистый пропидий, в качестве вещества, придающего проницаемость оболочке клеткиэ - сапонин или диги- тонин5 или нигтзтинэ обработку клеток

5 1575931

ведут вначале йодистым пропидием, арацию С спермы определяют из соотнозатем сапонином или дигитониномэ илишения

нистатином, регистрацию флуоресцен-г /(Fz-F 3)-(Fj-F4) ..„лл.3

« МЛН/ММ ,

ции проводят на-фотоэлектронной уста-, te

новке, причем отдельно измеряют флуо-где с( коэффициент, полученный умноресценцию буферного раствора йодисто-жением тангенса крутизны каго пропидия (F0), буферного растворалибровочной кривой на степень

йодистого пропидия и спермы (Fj, бу-предварительного разбавления

ферного раствора йодистого пропидия,Ю спермы,

спермы и сапонина (Рг)э буферного ра-а количество М живых клеток - из соствора йодистого пропидия и сапонинаотношения

(F3), буферного раствора (F4), буфер-М 100- --1-- --- -Ј::----100%.

кого раствора и спермы (F5), концент-(FZ-F S)-(F5--F4)

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к искусственному осеменению животных. Целью изобретения является повышение производительности и точности способа. Пробу спермы обрабатывают йодистым пропидием, затем дигитонином или сапонином или нистатином, проводя регистрацию флуоресценции на флуориметре. Концентрацию C спермы определяют из соотношения C=Α^.(F₂-F₃)-(F₅-F₄)/F₀ млн/мм³, где F₀ - флуоресценция буферного раствора йодистого пропидия

F₂ - то же, спермы и сапонина

F₃ - то же, буферного раствора йодистого пропидия и сапонина

F₄ - то же, буферного раствора

F₅ - то же, буферного раствора и спермы

α - коэффициент, полученный умножением тангенса крутизны калибровочной кривой на степень предварительного разбавления спермы.