Способ определения содержания белка в дрожжевых клетках Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 C12Q1/02 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для контроля за содержанием белка в клетках при лабораторном и промышленном культивировании дрожжевых клеток.

Целью изобретения является ускорение и повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом..

Отбирают пробу клеток из среды культивирования, дезинтегрируют клеточные мембраны путем 4-6 мин инкубации со смесью детергентов 0,02 об.% тритона X 100 и 0,03-0,04 мае. % цетилтриметиламмоний бромида, осаждают дезинтегрированные клетки в течение 10-15 мин инкубации с раствором 10 мас.% трих- лоруксусной кислоты и 5,0-7,5 мас.% MgSCM1 7H20, центрифугируют, отделяют супернатант и разводят осадок буферным раствором. К ресуспендированному осадку добавляют флуоресцентный реагент на аминогруппу (флуорескамин или ортофталевый альдегид), проводят его реакцию с белком и измеряют интенсивность флуоресценции продуктов реакции (F).

На чертеже показаны кривые, характеризующие предлагаемый способ.

Для определения концентрации белка в пробе строят две калибровочные кривые (см. чертеж ), одна из которых отражает зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации белка, а другая - от коли- чества биомассы в пробе. По наименьшему .из двух предельных значений флуоресценции (Рпред). выше которых нарушается линейная зависимость F от концентрации белка, устанавливают диапазон измеряемых концентраций белка и биомассы. Настраивают чувствительность флуориметра на FCT 100% по- пробе с максимальной допустимой концентрацией стандартного белка (FCT Рпред), измеряют интенсивность флуоресценции исследуемой пробы и рассчитывают концентрацию (мг/мл) дрожжевого белка Сб по формуле

Ce CcTl -f-K,

где Сет - максимальная концентрация стандартного раствора белка;

FCT, Fo, FX- интенсивности-флуоресценции контрольной, стандартной и измеряемой проб соответственно;

f - фактор разведения - объем ресус- пендированного осадка / объем исходной пробы;

К-пересчетный коэффициент перехода от концентрации стандартного белка к концентрации дрожжевого белка.

Кроме того, при проведении реакции дрожжевого белка с флуорескамином с целью повышения чувствительности способа пробу дрожжевых клеток готовят в борат- ном буфере с рН 9,45-9,55.

Пример 1. Для определения белка в дрожжевых клетках C.maltosa, культивируемых на н-парафинах. по реакции с флуорескамином в предварительных опытах измеряют при фиксированной чувствительности флуориметра зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации в пробе дрожжевой биомассы и от концентрации стандартного белка (БСА). Устанавливают, что раньше (при F FM) нарушается линейность сигнала для концентрации БСА. По найденной величине FM определяют предельную концентрацию биомассы в пробе Сш 0,63 мг/мл и максимальную концентрацию стандартного раствора БСА С2М -025 мг/мл. Затем в специальной серии 10- 20 проб параллельно проводят определение

белка предлагаемым методом и методом Кьельдаля и вычисляют пересчетный коэффициент К 1,48.

Далее способ осуществляют следующим образом. Отбирают 0,1 мл дрожжевой

суспензии, взятой из 12-й секции промышленного ферментера и содержащей 19-24 мг/мл биомассы. Добавляют к ней 1 мл ли- зирующего реагента RI, пермешивают и инкубируют 2-3 мин. Затем добавляют 1 мл

осаждающего реагента R2, инкубируют 10 мин, центрифугируют 10 мин при 4 тыс об/мин. Полученный супернатант сливают и осадок ресуспендируют в 5 мл боратного буфера (0,1 М, рН 9,5).

Таким образом, фактор разведения исходной ДС f 5 мл/0,1 мл 50, что соответствует конечной концентрации биомассы Скон Сисх/f 0,38-0.48 мг/мл и не превышает предельной концентрации

CIM 0,63 мг/мл.

Теперь берут 0,5 мл ресуспендирован- ного осадка, добавляют 0,2 мл люминесцентного реагента Яз с ФАМ, быстро перемешивают, инкубируют 4-5 мин и добавляют 3 мл боратного буфера (0,1 М, рН 9,5).

Перед измерением флуоресценции проводят настройку чувствительности флуориметра Квант-5 (F 100%) по пробе со

стандартным раствором БСА (+ 0,2 мл мин инкубации + 3 мл боратного буфера). Затем измеряют интенсивность флуоресценции в исследуемой пробе, при /18036 400 нм и АИСП 480 нм Fx 65. Также измеряют

интенсивность флуоресценции контрольной пробы, Fo 5.

Содержание белка з исходной ДС рассчитывают по формуле

() f K 11, 68 мг/мл. Процентное содержание белка в клетках определяют по формуле Сл СдБ(м(/мп).11,68 -5flMac о/ СДБ СслКмл) 20 58мас

П р и м е р .2. Для определения белка в дрожжевых C.maltosa. культивируемых на н-парафинах, по реакции с ортофталевым альдегидом, так же как в примере 1, вначале измеряют зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации дрожжевой биомассы и от концентрации стандартного белка (БСА). Устанавливают, что раньше при F FM нарушается линейность сигнала для концентрации биомассы. По величине FM определяют предельную концентрацию биомассы в пробе CIM 6 мг/мл и максимальную концентрацию стандартного белка Сам 1,5 мг/мл. Затем определяют пересчетный коэффициент от концентрации БСА к кон- центрации дрожжевого белка К 1,78. После этого проводят определение белка в исследуемой пробе . взятой из 12-й секции промышленного ферментера. К 0,1 мл пробы добавляют 1 мл лидирующего pea- гента RI, инкубируют 2-3 мин, добавляют 1 мл осаждающего реагента Ra, инкубируют 10 мин и центрифугируют образец в течение 10 мин при 4 тыс. об/мин. Супер- натант сливают, а остаток растворяют в 0,6 мл 0,1 М NaOH. Это соответствует разведению исходной суспензии в 6 раз (f 0,6 мл/0,1 мл 6). При исходной концентрации биомассы Скл 20 мг/мл конечная концентрация в разведенной пробе составляет С конеч 3,3 мг/мл и лежит в середине линейного диапазона концентрированной зависимости F от Скл.

Затем проводят реакцию с ортофтале- вым альдегидом. Перед опытом к люминесцентному реагенту Ra добавляют 10 мл дитиотреитола (на 10мл R3 0,5 мл, 30 мг/мл дитиотреитола в этаноле). Далее к 0,1 мл ресуспендированного осадка добавляют 1 мл реагентав RS, инкубируют 10 мин, добавляют 3 мл 0,5 М NaOH, инкубируют еще 10 мин и измеряют интенсивность флуоресценции Рх(Лвозб 365 нм, Лисп-440 им) на флуориметре Квант, предварительно настраивают чувствительность флуориметра (F 100%) по пробе со стандартным раствором БСА Сет С2М 1,5 мг/мл. Измеряют также интенсивность флуоресценции конт- рольной пробы FO Ю. Подставляют полученное значение интенсивности флуоресценции исследуемой пробы Fx 78 и другие измеренные показатели в формулу и рассчитывают весовое содержание белка

СдБ°100-10() 6 1 78 12-1мг/Мл Процентное содержание белка в биомассе определяют по фромуле

СдБ ,1/20 61мас%. :

AU(MVMI)

Таким образом, в разработанном способе предложены менее трудоемкие и более эффективные операции дезинтеграции

дрожжевых Клеток и их осаждения. Повышена точность определения концентрации белка зэ счет предварительной оценки линейной зависимости флуоресценции от концентрации стандартного белка и биомассы, установления наименьшего из двух пре дельных значений флуоресценции, по которому настраивают чувствительность прибора, а также определения пересчетного коэффициента К, учитывающего видоспе- цифичность флуоресцентного сигнала для различных белков.

Формул а изобретения

1. Способ определения содержания белка в дрожжевых клетках, включающий дезинтеграцию клеток, осаждение белка раствором трихлоруксусной кислоты, проведение реакции белка с флуореска- мином или ортофталевым альдегидом и определение содержания белка в пробе по флуоресценции продуктов реакции, отличающийся тем, что. с целью ускорения и повышения точности способа, дезинтеграцию клеток проводят путем их обработки в течение 4-6 мин смесью Тритона Х-100 в концентрации 0,02 об.% и цетилтриметиламмоний бромида в концентрации 0,03-0,04 мас.%, осаждение белка ведут в течение 10-15 мин, при этом к раствору трихлоруксусной кислоты добавляют МдЗСм 7Й20 в концентрации 5,0-7,5 мае. %, при проведении реакции с флуорескамином или ортофталевым альдегидом строят две калибровочные кривые, одна из которых отражает зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации белка в стандартном растворе, а другая - от количества биомассы в пробе, и определяют концентрации белка и биомассы по меньшему из двух предельных значений флуоресценции, а концентрацию Cf, мг/л, дрожжевого белка рассчитывают по формуле

C Gcnp-if-f-K,

где Сет - максимальная концентрация стандартного раствора белка;

FCT, FO, FX - интенсивности флуоресценции контрольной, стандартной и измеряемой проб соответственно;

f - фактор разведения - объем ресуспендированного осадка/объем исходной пробы;

К- пересчетный коэффициент перехода от концентрации стандартного белка к концентрации дрожжевого белка.

2. Способ по п. 1, от л и ч а ю щий ся жевого белка с флуорескамином, пробу тем, что, с целью повышения чувствительно- дрожжевых клеток готовят в боратном буфе- сти способа при проведении реакции дрож- ре с рИ 9,45-9,55.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для контроля за содержанием белка при лабораторном и промышленном культивировании дрожжевых клеток. С целью ускорения и повышения точности способа из дрожжевой суспензии, отбирают пробу, содержащую 0,9-1,5 мг биомассы, инкубируют ее со смесью детергентов, лизирующей клеточные мембраны, осаждают белок и клетки раствором 10%- ной трихлоруксусной кислоты и MgSO .осадок ресуспендируют в новом растворе и проводят реакцию с люминесцентным реагентом на аминогруппу (флуорескамин или ортофталевый альдегид). При проведении реакции с флуорескамином или ортофтале- вым альдегидом строят две калибровочные кривые, одна из которых отражает зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации белка в стандартном растворе, а другая от количества биомассы в пробе, и определяют предельно допустимые концентрации белка и.биомассы по меньшему из двух.предельных значений флуоресценции, а концентрацию Cg. мг/л, .дрожжевого белка рассчитывают по формуле Fx-Fo Сб С ст f-K , где Сет- максимальная сл с концентрация стандартного раствора белка; FCT, Fo, FX - интенсивность флуоресценции контрольной, стандартной и измеряемой проб соответственно; f - фактор разведения - объем ресуспендирован- ного осадка 7 объем исходной пробы; К - пересчетный коэффициент перехода от концентрации стандартного белка к концентрации дрожжевого белка. 1 з.п.ф-лы, 1 ил. Xi hO СЛ