Способ определения липополисахаридных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови Советский патент 1992 года по МПК G01N33/52 G01N33/53 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в иммунодиагностике инфекционных заболеваний.

Цель изобретения - повышение точности способа.v

Способ осуществляют следующим образом.

Осуществляют встраивание определяемого антигена (АГ) в мембрану липосом, включение маркера внутрь липосомы, проведение реакции комплемент-зависимого лизиса с последующим определением АГ по выходу маркера из лизированных липосом. Перед включением маркера определяемый АГ обрабатывают 0,1 N сцелочью при нагревании до 95°С в течение 10 мин. В качестве маркера используют водорастворимый флуоресцентный краситель кальцин. Определяют интенсивность флуоресценции маркера после постановки реакции комплемент-зависимого лизиса липосом с контролями и рассчитывают долю иммунного лизиса по выражению

ю

о

F6-(F3-Fi) + F5 F2-(F3-Fi) + F4

х 100%, (1)

о ы

где Fi - интенсивность флуоресценции суспензии липосом;

F2 - интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой стандартной антисыворотки и комплемента:

Рз - интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой только стандартной антисыворотки;

F4 интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой только комплемента;

FS - интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой сыворотки больного и комплемента;

Fe - интенсивность флуоресценции суспензии липосом с добавкой сыворотки боль- ного, комплемента, стандартной антисыворотки.

Концентрацию липополисахаридных антигенов определяют по калибровочной кривой.

Пример 1. Получение липосомаль- ного иммунореагента.

Раствор липидов - яичный лецитин, холестерин, дицетилфосфат(в молярном соотношении 2:1, 5:0,22) в смеси хлороформ, метанол (2:1 пообъему)упариваютна роторном- испарителе до образования липидной пленки. Полученную пленку липидов растворяют в 1,5 мл диэтилового эфира, добавляют 0,5 мл раствора липополисахарида (ЛПС), предварительно обработанного 0,1 N NaOH и содержащего 175 мМ кальцеина.

Полученную двухфазную систему подвергают действию ультразвука в дезинтеграторе при частоте 22 кГц в течение 20-30 с. Полученную эмульсию упаривают на роторном испарителе до образования твердого геля при 35-45 КПа. а затем при 25 КПа до полного удаления эфира. Невключающийся маркер отделяют гельфильтрацией на колонке с сефадексом G-50. Полученный липосомальный иммунореагент сохраняется при +4°С в течение 3-4 месяцев без утраты своей биологической активности.

П р и м е р 2. Количественное определение содержания ЛПС в сыворотке крови больного.

В две пробирки вносят по 10 мкл сыворотки больного и по 20 мкл антисыворотки с разведением 1:32.

Через 10 мин инкубации при комнатной температуре добавляют 40 мкл (60 нмолей липида) суспензии липосомального иммунореагента, дополнительно инкубируют 10 мин, после чего вносят 10 мкл триссолевого буфера, содержащего 5 мМ MgCfe и 1,5 мМ CaCl2 и 20 мкл комплемента, в качестве которого используют сыворотку крови морской свинки или кролика. Объем смеси доводят до ТОО мкл трис-солевым буфером. Параллельно ставят контроли на неспецифический лизис липисом антисывороткой и исследуемой сывороткой больного в присутствии комплемента. Через 30 мин реакции останавливают 3 мл трис-солевого буфера. Флуоресценцию измеряют в кювете с длиной оптического пути 1 см или пробирке при длине волн эмиссии и возбуждения 493 и 520 нм соответственно.

Расчет величины иммунного лизиса

проводится по уравнению (1), при этом берутся средние значения двух параллельных измерений. По калибровочной кривой опре- деляют содержание ОПС-антигена в мкг/мл, которое для трех образцов сывороток больных сальмонеллезом составило 0,7; 11,2; 29,5 мкг Л ПС/мл образца сыворотки крови больного.

В табл. 1 отражены результаты определения интенсивности флуоресценции и расчет величины концентрации и процента иммунного лизиса для трех различных сывороток больных с различными содержаниями соматического 0-антигена Salmonella fyphlmurium в сыворотке крови.

П р и м е р 3. Повышение воспроизводимости и точности метода.

Липосомы приготовили, как указано в примере 1, определение антигена проводят,

как указано в примере 2. В табл. 2 приведены значения доли иммунного лизиса и концентрации антигена, определенного с одной партией липосом в сыворотке крови больного, что отражает воспроизводимость

метода.

В табл. 3 приведены значения определения величин иммунного лизиса, соответствующего определенным концентрациям ЛПС-антигена в растворе. Для проведения

анализа взяты приготовленные каждый раз заново партии липосомального иммунореагента, что отражает воспроизводимость метода.

П р и м е р 4. Построение калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кривой готовят ряд разведений стандартного раствора ЛЛС S. ityphlmurulm в трис-солевом

буфере. 10 мкл раствора ЛПС каждой концентрации смешивают с 20 мкл стандартной антисыворотки. Используют такое разведение антисыворотки, которое дает 90-60% от максимального иммунного лизиса. Определяют иммунный лизис в тех же условиях, что ис образцами сыворотки больного. Ставят также контроли: липосомы только с буферным раствором, липосомы только с антисывороткой, липосомы только с

комплементом. За 100% принимают величину иммунного лизиса липосом в отсутствие ЛПС. Диапазон измеряемых концентраций от 0,5 до 200 мкл/ЛПС/мл исходного раствора. Строят кривую зависимости величины иммунного лизиса от логарифма концентрации Л ПС в растворе.

Предложенный способ позволяет в 2-3 раза повысить точность в сравнении с известным способом.

Изобретением может быть использовано в практике здравоохранения для экспресс- диагностики инфекционных заболеваний и определения тяжести их протекания контроля загрязнения окружающей среды, в научно- исследовательской практике для изучения динамики антигенемии при экспериментальном инфицировании животных.

Предложенный способ легко может быть автоматизирован, требует малого (10 мкл) количества исследуемой сыворотки.

0

5

Формула изобретения Способ определения липополисахарид- ных антигенов микроорганизмов в сыворотке крови, включающий встраивание антигена в мембрану липосом, включение маркера внутрь липосом, проведение реакции комплементозависимого лизиса с последующим определением антигена по выходу маркера, отличающ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, липополисахариды перед встраиванием в липосомы обрабатывают 0.1 н.щелочью при нагревании до 95°С в течение 10 мин, в качестве маркера используют кальцеин, невключившийся маркер отделяют гельфильт- рацией, а выход маркера определяют флюориметрически.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в иммунодиагностике инфекционных заболеваний. Цель изобретения - повышение точности способа. Определяемый антиген обрабатывают 0,1 н.щелочью при нагревании до 95°С в течение 10 мин, встраивают его в мембрану липосом, внутрь липосомы включают маркер, в качестве которого используют водорастворимый флуоресцентный краситель кальция, и определяют интенсивность флуоресценции маркера после постановки реакции комплементзависимого лизиса и по рассчитанной доле иммунного лизиса по калибровочной кривой определяют концентрацию липополисахаридных антигенов. Способ позволяет повысить точность определения в 2-3 раза. 3 табл.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3