Маркер оценки аттенуации вирусов полиомиелита Советский патент 1993 года по МПК A61K35/64 

Изобретение относится к вирусологии, а именно к средству оценки степени аттену- ации вирусов. Известно использование про- полиса и прополисных препаратов в медицине в терапевтических целях.

Цель изобретения - расширение ассортимента маркеров, используемых для оценки степени аттенуации вирусов за счет выявления новых дополнительных свойств прополиса, ранее неизвестных.

Для достижения цели в качестве маркера используют экстракт прополиса.

В основу маркера положен тот факт, что динамика подавления репродукции вакци- онных вариантов вируса полиомелита в культуре клеток, при наличии в поддерживающей среде экстракта прополиса, значительно опережает аналогичный процесс, касающийся для вариантов вируса полиомиелита. Если разница показателей интен- сивности подавления репродукции изолятов вируса полиомиелита в культуре клеток при наличии и отсутствии прополиса (0,8%) в поддерживающей среде составляет 2,0 Ig ЦПДбО/мл, то их относят к диким. При 3,0 Ig ЦПДбО/мл - к вакцинным, а если разница этих показателей находится в пределах 2,0-3,0 Ig ЦПД50/М/1, то их относят к

промежуточным. Технология определения предлагаемого нами маркера несложна по выполнению, не связана со значительными материальными затратами, так как исключает использование дорогостоящих материалов реактивов.

Использование предлагаемого маркера для оценки степени аттенуации вирусов показало, что информация, полученная с помощью этого признака, полностью коррелирует с антигенным признаком. Во всех опытах было отмечено полное совпадение антигенного (известного) маркера с новым маркером, предлагаемым нами.

Пример. Была дана оценка степени аттенуации 60 изолятов вируса полиомиелита, выделенных от больных полиомиелитом, из образцов проб водных объектов (сточные воды, вода открытых водоемов), а также стандартных штаммов вируса полиомиелита, диких и вакционных по ряду известных, а также по предлагаемому нами маркеру.

Изготовление экстракта прополиса (маркера).

Используют 8,0%-ный водный экстракт прополиса, собранный на пасеках пчеловодами колхоза Победа Рыбинского района ССР Молдова, который получают по следуЁ

VI

О О

ел о

00

ющей методике: отвешивают 20,0 г прополиса, растирают в ступке, затем эту измельченную массу высыпают в стеклянную колбу, куда добавляют до 100,0 мл дистиллированной воды. Экстракцию проводят при 42,0+ 0,1° С втечение4 суток, периодически встряхивая (в течение 10 мин содержа- ние колбы 5-6 раз в день. Полученный раствор стерилизуют через асбестовый фильтр и сохраняют в объеме 20-25 мл в темных флакончиках, хорошо закупоренных при температуре +40°С. После стабилизации устанавливается желто-светлый (лимонный) цвет. При использовании водный экстракт прополиса разбавляют таким образом, чтобы конечная концентрация в поддерживающей среде клеток составила 0,8±0,1%.

Приготовление перевиваемой культуры НЕр-2 осуществляют следующим образом.

Перед посевом культуры обязательно проводят просмотр и оценку монослоя. Отбирают культуру со сплошным монослоем клеток имеющих типичную для данной линии морфологию, с четко выраженными границами между клетками. Клетки снимают со стекла матрасов трипсин-версеном. Для этого приготавливают смесь равных объемов 0,25%-ного раствора трипсина и раствора версена, подогревают ее в водяной бане до 30-35°С. В начале с матраса выливают питательную среду, клеточный слой промывают 3 раза фосфатно-буферным раствором (рН 7,5), не содержащим ионы кальция и магния. Затем тепловой смесью (трипсинвёрсен) заливают монослой культуры клеток так, чтобы все участки были покрыты жидкостью. В матрасы, объемом 100, 250 и 1000 мл, раствор добавляют, соответственно, по 10, 15 и 30 мл. Матрасы встряхивают и помещают в термостат (37°С) на 15 - 20 мин до полного отделения клеток от поверхности стекла. Крупные конгломераты клеток диспергируют, пипетируя несколько раз клеточную взвесь. Суспензию клеток центрифугируют 10 мин при 2000 об./мин, смесь трипсин-версен удаляют. Осажденные центрифугированием клетки ресуспен- дируют в небольшом объеме ростовой питательной среды, количество клеток подсчитывают в счетной камере Горяева Взвесь клеток контролируют на бактериальную стерильность, разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1,0 мл содержалось 60 тыс. клеток. В качестве среды для выращивания клеток используют среду Игла, среду 199. Игла-МЕМ с добавлением телячьей сыворотки крупного рогатого скота - 10% и антибиотиков. Перевиваемую

культуру НЕр-2 разливают в пробирки по 1,0 мл. В качестве поддерживающей среды ис пользуют те же вышеприведенные питательные среды без добавления сыворотки.

Обновление сплошного монослоя клеток новой генерации наблюдают через 5-6 суток. Титрование изолятов вируса полиомиелита того или иного иммунологического типа с целью изучения степени их аттенуации,

а также стандартных вакцинных и диких штаммов вируса полиомиелита проводят в культуре клеток НЕр-2, методом конечного разведения по цитопатогенному действию и выражают в Ig (ЦПДзо/мл). Для титрования

5 штаммов вируса полиомиелита в начале готовят его разведение, обычно десятикратные от 10 до . Во все пробирки вносят по 9,0 мл стерильного физиологического раствора или раствора Хэнкса. Затем в пер0 вую пробирку вносят 1,0 мл вирусосодержа- щего материала и получают разведение (1:10). При помощи новой пипетки содержимое первой пробирки тщательно перемешивают и 1,0 мл переносят во вторую

5 пробирку, получая разведение (1:100) и т.д. до 108.

Затем водный экстракт прополиса (8,0%) в объеме 0,5 мл соединяют с равным объемом вирусосодержащёго материала

0 каждого разведения. Смесь экстракта прополиса и вируса выдерживают в течение 1 ч при 37°С. Предварительно перед заражением монослоя культуры НЕр-2 смесью (вирус + экстракт прополиса) производят 3 раза

5 отмывание культуры клеток от сыворотки раствором Хэнкса, рН 7,4 или раствором Эрла - рН 7,6. На каждое десятикратное разведение вирусосодержащего материала используют по 4 пробирки с культурой кле0 ток. Смесь экстракта прополиса и вируса в объеме 0,2 мл добавляют в пробирки с.культурой клеток, в которые предварительно заливают поддерживаемую среду в объеме 0,8 мл. Пробирки помещают в термостат в спе5 циальных лотках в горизонтальном положении. Состояние зараженных культур периодически проверяют под световым микроскопом в течение 7-ми дней. Результат цитопатического действия ЦПДбо вируса

0 считается положительным, если не менее половины клеток в культуре подвергались специфической дегенерации.

Опыт сопровождается следующим контролем:

5 а). Контроль репродукции стандартных штаммов вируса полиомиелита: титруют вирус полиомиелита, в культуре клеток НЕр-2 при отсутствии и наличии экстракта прополиса в поддерживающей среде клеток в концентрации (0,8%):

б). Контроль культуры клеток: используют интактную культуру клеток НЕр-2 при отсутствии и наличии в поддерживающей среде (0,8%) экстракта прополиса. Титр (50,0% эффективной дозы) вычисляют по методу Рида-Менга и методом пробитое, используя специальные таблицы (Методические рекомендации по санитар- но-вирусологическому контролю объектов окружающей среды, 1982, М., 75, стр. под ред. проф. Дроздова С.Г. и д.м.н. Казанцевой В.А.).

Результаты оценки динамики подавления интенсивности репродукции штаммов вируса полиомиелита в культуре клеток НЕр-2 при наличии и отсутствии водного экстракта прополиса в поддерживающей среде учитывают только при соблюдении следующих контролей:

1. Монослой незараженной культуры НЕр-2 (при наличии и отсутствии в поддерживающей среде экстракта прополиса в конечной концентрации 0,8%) должен сохраниться до конца опыта, т.е. до седьмых суток включительно после заражения (контроль культуры клеток).

2. Разница в интенсивности репродукции в культуре клеток НЕр-2 при отсутствии

и наличии экстракта прополиса в поддерживающей среде для аттенуированных стандартных штаммов вируса полиомиелита составляет более 103 ° ЦПДбо/мл, тогда как для диких стандартных штаммов вируса

полиомиелита этот показатель составляет

Ю2 °ЦПД50/мл.

Формула изобретен и я Применение0,8%-ного раствр ра пропо- лиса в качестве маркера оценки аттенуа- ции вирусов полиомиелита.

Изобретение относится к области вирусологии. Цель - использование экстракта прополиса в качестве маркера. Сущность изобретения: динамика подавления репродукции вакцинных вариантов вируса полиомиелита в культуре клеток при наличии в среде экстракта прополиса опережает аналогичный процесс, касающийся диких вариантов. Положительный эффект: расширение ассортимента маркеров.