СПОСОБ КОНЦЕНТРАЦИИ ВИРУСОВ ИЗ ЖИДКИХ СРЕД Российский патент 2009 года по МПК C12N7/02 

Изобретение относится к области медицины, а именно вирусологии и биотехнологии, и может быть использовано для концентрации вирусов из воды, водных растворов, биологических сред; для выявления вирусов в воде питьевой, сточной, воде открытых водоемов, которые используются как источники водоснабжения, водопроводной воде, воде подземных источников, питьевой воде бутылированной, воде морской и пресных водоемов, которые используются для рекреационных целей, воде плавательных бассейнов; для очистки вирусных суспензий, используемых для изготовления вирусных антигенов и вакцин, очистки вирусов, полученных из тканевых культур, от клеточного детрита.

Известен способ концентрации энтеровирусов из водопроводной и речной воды при помощи ионообменных смол АВ-17, АВ-17-8, АВ-17-2П, 1К (искусственные сорбенты, представленные анионитами, а именно аминосмолами, полученными из формальдегида с мочевиной, анилином, гуанидином). / Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды. // Москва, 1982, 75 с., п.3.1.3.2, - с.14/. Концентрация вирусов при помощи ионообменных смол осуществляется следующим образом. Сухую ионообменную смолу замачивают в течение 3 суток в дистиллированной воде. Потом воду сливают и смолу обрабатывают смесью равных по объему, приготовленных непосредственно перед использованием растворов 2% HCl и 10% NaCl. Продолжительность обработки 24 часа. После этого смолу отмывают дистиллированной водой до нейтрального рН=7,0. Перед концентрацией рН исследуемой пробы воды (5 или 10 л) доводят до значений 5,5-6,0. Затем заполняют колонку диаметром 1,2-1,3 см подготовленным слоем сорбента толщиной 10-12 см. Колонку уравновешивают раствором суспензии смолы с рН=5,6-6,0. Пробу воды (5 л) пропускают через колонку со скоростью 10-12 мл/мин. Продолжительность концентрации - 12-16 ч. После завершения концентрации осуществляют десорбцию вирусов из смолы при помощи фосфатного буфера. Недостатками этого способа являются длительность подготовки сорбента, дополнительное использование колонки, продолжительность процесса концентрации - 12-16 ч, использование большого объема воды - 5 л.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ концентрации вирусов из воды при помощи природных сорбентов, а именно 5% геля бентонита (Широбоков В.П., Гирин В.Н., Якименко А.И. и др. Применение бентонита для выявления энтеровирусов у человека и во внешней среде. // Методические рекомендации. Киев, 1986, 23 с.) Схема концентрации энтеровирусов из водной среды представлена в таблице 1. Способ осуществляется следующим образом. Сухой бентонит диспергируют в деионизированной воде. Для преобразования бентонита в натриевую форму к суспензии добавляют углекислый натрий. Смесь оставляют на сутки при комнатной температуре для набухания, после чего смесь кипятят в течение 1 часа. Охлажденную смесь центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в 1 л дистиллированной воды и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость удаляют. Отбирают приблизительно 2/3 верхней части осадка, содержащей суспензию геля бентонита, остаток суспензии ресуспендируют в 1 л деионизированной воды и снова центрифугируют в течение 20 минут при 4000 об/мин. Отмытый осадок бентонита заливают 3 л воды и встряхивают в штудтельаппарате 3-4 часа. После этого суспензию центрифугируют в течение 5 минут при 1000 об/мин, 2/3 верхней части осадка отбирают, еще раз суспендируют в воде, надосадок декантируют. Отбирают 2/3 однородной части геля бентонита, которую суспендируют в 0,14 М раствора хлористого натрия и снова осаждают, как указано выше. Фракционирование повторяют трижды, увеличивая продолжительность центрифугирования и удаляя нижнюю часть осадка. После такой обработки бентонит представляет собой мелкодисперсную суспензию. Ее суспендируют в 95 объемах деионизированной воды, получая 5% суспензию геля бентонита. Полученный гель автоклавируют при 136°С в течение 20 минут. Срок хранения такого геля не ограничен. Полученный 5% гель бентонита используют для концентрации вирусов из воды, водных растворов, культуральной жидкости.

Таблица 1.
Схема концентрации вирусов из водной средыЭтапИсследуемый материалОбработкаАдсорбцияСточная вода (250 мл)1) вносят 3,0 г NaCl до 0,1 М концентрации;
2) вносят 0,5 мл 5% геля бентонита;
3) вносят 1 М HCl раствор до рН=4,5-5,0;
4) встряхивание 4-5 мин;
5) центрифугирование при 1000 об/мин 7-10 минОбессоливаниеОсадок (комплекс вирус + бентонит)1) вносят 10 мл дист. воды (рН-1,5);
2) встряхивание 4-5 мин;
3) центрифугирование при 3000 об/мин 7-10 мин;ЭлюцияОсадок (комплекс вирус + бентонит)1) вносят 1 мл 0,05 М раствора трис-буфера (рН-8,2-9,0);
2) встряхивание 4-5 мин;
3) центрифугирование при 3000 об/мин 7-10 мин;
4) отбирают элюат, деконтаминируют и исследуют на наличие в нем вирусов или вирусных антигенов.

Известный способ включает помещение сорбента в пробу жидкой среды, выдерживание временного интервала с последующим центрифугированием исследуемой пробы, удаление надосадочной жидкости, получение комплекса вирус + сорбент и последующую элюцию вирусов. Недостатками способа являются продолжительность и трудоемкость приготовления геля бентонита, нестандартизированностъ сорбента, которая зависит от места его добычи.

В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа концентрации вирусов из жидких сред, в котором применение гидрогеля метилкремниевой кислоты сокращает продолжительность и трудоемкость способа и повышает процент выявления вирусов при исследовании различных жидких сред.

Поставленная задача решается тем, что в способе концентрации вирусов из жидких сред, который включает помещение сорбента в пробу жидкой среды, выдерживание временного интервала с последующим центрифугированием исследуемой пробы, удаление надосадочной жидкости, получение комплекса вирус + сорбент и последующую элюцию вирусов, согласно изобретению в качестве сорбента используют гидрогель метилкремниевой кислоты (ГГМКК), который обладает адсорбционными свойствами по отношению к биологическим объектам вирусной природы, временной интервал выдерживают от 20 минут до 24 часов при температуре от +4°С до +22°С, а получение комплекса вирус + сорбент осуществляют без проведения этапа обессоливания.

Согласно изобретению ГГМКК, способный в концентрации не менее 30 мг/мл адсорбировать не менее 96% вирусных частиц из водных сред, помещают в пробу водной среды, при этом исследуемую пробу подкисляют раствором кислоты до рН=5,0.

Согласно изобретению ГГМКК, который способен в концентрации не менее 2 мг/мл адсорбировать не менее 90% вирусных частиц из биологических сред, помещают в пробу биологической среды.

Заявители изобретения являются изобретателями и заявителями способа получения сорбента на основе гидрогеля метилкремниевой кислоты (заявка № а 2006 10083), в котором, благодаря новому способу получения, указанный сорбент имеет объем пор не менее 0,8 см³/г и обладает высокой адсорбционной активностью в отношении веществ с большой молекулярной массой (5-900 кД) и различных биологических объектов, в том числе вирусной природы. Гидрогель метилкремниевой кислоты - это новый эффективный сорбент, который имеет глобулярную структуру пористой кремнийорганической матрицы. На ее поверхности присутствуют гидроксильные группы, благодаря чему поверхность глобул и пор активно сольватируется полярными молекулами воды, и метильные группы, обусловливающие гидрофобные свойства и сродство к тканям и биосубстратам организма. Сорбент ГГМКК безопасен, имеет высокую селективность, адсорбционная емкость по конго красному достигает 3,0-3,5 мг/г (или 4,5-5,0 мкмоль/г). Используется как сорбент в различных отраслях медицины и ветеринарии.

Цель изобретения состоит в повышении эффективности концентрации вирусов из проб жидких сред, уменьшении стадий в процедуре выполнения, сокращении времени концентрации, создании возможности концентрации вирусов из минимальных объемов жидких сред, использовании для концентрации готового вещества (сорбента), состав и качество которого гарантируется соответствующими ФС и ТУ.

Способ осуществляется следующим образом. ГГМКК, полученный способом, заявленным в № а 2006 10083, имеющий адсорбционные свойства относительно биологических объектов вирусной природы, помещают в пробу жидкой среды, выдерживают от 20 минут до 24 часов при температуре от +4°С до +22°С. ГГМКК, способный в концентрации 30 мг/мл адсорбировать не менее 96% вирусных частиц из водной среды, помещают в пробу водной среды, а также в пробу биологической среды, загрязненные вирусами. Проводят адсорбцию вирусов, после чего ГГМКК концентрируют центрифугированием и удаляют надосадочную жидкость. Затем осуществляют элюцию вирусов и отделяют ГГМКК от раствора центрифугированием. В надосадочной жидкости осуществляют индикацию и идентификацию вирусов.

Пример 1. Концентрация вирусов из проб сточной воды.

Способ осуществляется как описано в п.п.1.2, при этом пробу воды (500 мл предварительно осветленной сточной воды) подкисляют при помощи 1 М HCl до рН=5,0, в подкисленную пробу помещают сорбент ГГМКК в количестве 1 г и выдерживают 20 минут при температуре 20°С. После экспозиции пробу с сорбентом центрифугируют при 1000 об/мин. в течение 20 минут. Надосадочную жидкость удаляют и получают комплекс вирус + сорбент, процесс обессоливания отсутствует.

Пример 2. Концентрация вирусов из проб питьевой воды.

Способ осуществляется как описано в п.п.1.2, при этом пробу воды подкисляют при помощи 1 М HCl до рН=5,0, в подкисленную пробу (10 л питьевой воды) помещают сорбент ГГМКК в количестве 20 г и выдерживают до 20 часов при температуре 20°С, надосадок осторожно сливают через край, оставляя на дне стеклянного сосуда 200 мл неплотного белого осадка. Полученный осадок (осадок + небольшое количество надосадка) встряхивают и переносят в стаканы или флаконы для центрифугирования по 250 мл и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 20 минут. Образовавшийся белый осадок также не плотный, поэтому надосадочную жидкость снова сливают через край, оставляя на дне флакона 20 мл. Этот осадок встряхивают, переносят в две пробирки для центрифугирования и повторно центрифугируют. После второго центрифугирования плотный осадок формируется на дне пробирок, надосадочную жидкость удаляют пастеровской пипеткой и получают комплекс вирус + сорбент, процесс обессоливания отсутствует.

Пример 3. Концентрация вирусов из проб воды открытых водоемов и подземных источников.

Способ осуществляется как описано в п.п.1.2, при этом пробу воды (2 л) подкисляют при помощи 1 М HCl до рН=5,0, в подкисленную пробу помещают сорбент ГГМКК в количестве 4 г и выдерживают до 20 минут при температуре 20°С. После экспозиции пробу с сорбентом центрифугируют при 1000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость удаляют и получают комплекс вирус + сорбент, процесс обессоливания отсутствует.

Пример 4.1. Концентрация вирусов из проб культуральной жидкости.

Способ осуществляется как описано в п.п.1.3, при этом в культуральную вирусосодержащую жидкость (КВЖ), содержащую ротавирус обезьян SA-11 с инфекционным титром 7,5 lg ТЦД₅₀/мл, добавляют сорбент ГГМКК из расчета 2 мг на 1 мл жидкости. Формирование комплекса ротавирус + сорбент осуществляют при температуре 20°С в течение 10 часов, периодически перемешивая. Образовавшийся комплекс ротавирус + сорбент выделяют низкоскоростным центрифугированием. В надосадочной жидкости отсутствие вируса контролируют, определяя инфекционный титр ротавируса титрованием по ЦПД в чувствительной культуре клеток. Результаты осуществления способа представлены в таблице 2.

Пример 4.2.

Способ выполняют как в примере 4.1, но ГГМКК помещают в культуральную жидкость из расчета 1,5 мг/мл. Результаты выполнения способа представлены в таблице 2.

Пример 4.3.

Способ выполняют как в примере 4.1, но ГГМКК помещают в культуральную жидкость из расчета 2,5 мг/мл. Результаты выполнения способа представлены в таблице 2.

Пример 4.4.

Способ выполняют как в примере 4.1, но ГГМКК помещают в культуральную жидкость из расчета 5,0 мг/мл. Результаты выполнения способа представлены в таблице 2.

Пример 4.5.

Способ выполняют как в примере 4.1, но ГГМКК помещают в культуральную жидкость из расчета 10 мг/мл. Результаты выполнения способа представлены в таблице 2.

Примеры 4.6-4.10.

Способ выполняют как в примерах 4.1-4.5, но используют культуральную жидкость, которая содержит вирус полиомиелита II типа штамм Себина с инфекционным титром 10,5 lg ТЦД₅₀/мл. Результаты выполнения способа представлены в таблице 2.

Примеры 5.1-5.5. Концентрация вирусов из проб плазмы крови человека.

Способ осуществляют как в п.3 и примерах 4.1.-4.5, но вместо вирусосодержащей жидкости используют плазму крови человека, которая содержит вирус везикулярного стоматита (ВВС), штамм Индиана. Результаты осуществления способа представлены в таблице 2.

Пример 6. Способ концентрации вирусов-колифагов из проб питьевой воды.

Способ осуществляется как описано в п.п.1.2 и в примере 2, только концентрируемые вирусы являются колифагами Т2 (бактериофаг эшерихии Т2), а ГГМКК вносят из расчета 50 мг/мл. После экспозиции пробу с сорбентом центрифугируют при 1000 об/мин в течение 20 минут, надосадочную жидкость удаляют и получают комплекс колифаг Т2 + сорбент, процесс обессоливания отсутствует.

Примеры осуществления способа с элюцией вирусов.

Пример 7.1.

Способ осуществляют как в примере 4.1., но удаленный низкоскоростным центрифугированием комплекс «ротавирус SA-11 + сорбент» помещают в раствор 0,14 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) с рН=8,5, объем которого в 10 раз меньше объема КВЖ, из которой был адсорбирован ротавирус. Полученную суспензию интенсивно встряхивают в течение 10 минут при температуре 20°С и оставляют в тех же условиях для десорбции еще на 20 минут. Сорбент удаляют низкоскоростным центрифугированием. Супернатантную жидкость, содержащую ротавирус, отбирают в стерильную пробирку, доводят ее рН до 7,2-7,4 1 М раствором HCl, и деконтаминируют. Инфекционный титр ротавируса в полученном супернатанте определяют по ЦПД титрованием микрометодом в культуре клеток НЕР-2. Одновременно, в этих же условиях титруют и образцы КВЖ, из которой адсорбируют ротавирус. Титрование повторяют в трех параллельных опытах. Титрование каждого образца проводят в 4 рядах лунок 96-лункового культурального планшета. Инфекционный титр ротавируса в культуральной жидкости и в образцах элюата рассчитывают по методу Кербера. Результаты выполнения способа представлены в таблице 3.

Пример 7.2.

Способ осуществляют как в примере 7.1, но элюцию проводят при рН=8,0. Результат выполнения способа представлен в таблице 3.

Пример 7.3.

Способ осуществляют как в примере 7.1, но элюцию проводять при рН=9,0. Результат виполнения способа представлен в таблице 3.

Пример 7.4.

Способ осуществляют как в примере 7.1, но элюцию проводят при рН=9,3. Результат выполнения способа представлен в таблице 3.

Пример 7.5.

Способ осуществляют как в примере 7.1, но элюцию проводят в 0,05 М трис-буферном растворе при рН=8,5. Результаты выполнения способа представлены в таблице 3.

Пример 7.6.

Способ осуществляют как в примере 7.5, но элюцию проводят при рН=8,0. Результаты выполнения способа представлены в таблице 3.

Пример 7.7.

Способ осуществляют как в примере 7.5, но элюцию проводят при рН=9,0. Результаты выполнения способа представлены в таблице 3.

Пример 7.8.

Способ осуществляют как в примере 4.6, но выделенный низкоскоростным центрифугированием комплекс «вирус полиомиелита II типа штамм Себина + сорбент» помещают в раствор 0,14 М фосфатно-солевого буфера с рН=8,5, объем которого в 10 раз меньше объема КВЖ, из которой был адсорбирован полиовирус. Полученную суспензию интенсивно встряхивают в течение 10 минут при температуре 20°С и оставляют в тех же условиях для десорбции еще на 20 минут. Сорбент удаляют низкоскоростным центрифугированием. Супернатантную жидкость, содержащую полиовирус, отбирают в стерильную пробирку, доводят ее рН до 7,2-7,4 1 М раствором HCl и деконтаминируют. Инфекционный титр полиовируса в полученном супернатанте определяют по ЦПД титрованием микрометодом в культуре клеток НЕР-2. Одновременно, в тех же условиях титруют и образцы КВЖ, из которой адсорбировали полиовирус. Титрование повторяют в трех параллельных опытах. Титрование каждого образца виполняют в 4 рядах лунок 96-лункового культурального планшета. Инфекционный титр полиовируса в культуральной жидкости рассчитывают по методу Кербера. Результаты выполнения способа представлены в таблице 3.

Пример 7.9.

Способ виполняют как в примере 7.8, но элюцию проводят в 0,05 М трис-буферном растворе при рН=8,5. Результаты виполнения способа представлены в таблице 3.

Пояснение. Элюцию вируса везикулярного стоматита из комплекса «вирус + сорбент» не проводили, поскольку цель состояла в максимальном очищении плазмы крови от вируса, а не в его концентрировании, в этом случае поиск условий десорбции ВВС не нужен.

Предлагаемый способ обеспечивает сокращение стадий в процессе выполнения, уменьшение времени концентрирования, возможность концентрации вирусов из минимальных объемов жидких сред, благодаря чему увеличивается точность и повышается процент выявления вирусов при исследовании различных жидких сред.

Таблица 3.
Эффективность элюции (десорбции) вирусов из комплексов «вирус + сорбент» в буферных растворах при различных значениях их ионной силы (рН).№/№ примераlg инфекционного титра вируса в исходной КВЖМ±мБуферный раствор для элюциирН буферного раствораlg инфекционного титра вируса в элюатеМ±мРотавирус обезьян SA-117.1.7,50; 7,25; 7,757,50±0,250.14 М ФСБ8,58,5; 8,25; 8,258,33±0,147.2.7,50; 7,25; 7,507,50±0,250.14 М ФСБ8,08,0; 7,5; 7,07,50±0,507.3.7,50; 7,25; 7,507,50±0,250.14 М ФСБ9,08,5; 8,25; 8,508,42±0,147.4.7,50; 7,25; 7,507,50±0,250,14 М ФСБ9,36,50; 7,0; 6,256,58±0,387.5.7,50; 7,25; 7,757,50±0,250,05 М трис-буфер8,58,50; 8,25; 8,508,42±0,147.6.7,50; 7,25; 7,757,50±0,250,05 М трис-буфер8,06,50; 6,75; 6,506,58±0,147.7.7,50; 7,25; 7,757,50±0,250,05 М трис-буфер9,05,25; 6,75; 6,06,17±0,80Вирус полиомиелита II типа штамм Себина7.8.10,50; 10,25; 10,7510,5±0,250.14 М ФСБ8,511,50; 11,25; 11,5011,48±0,147.9.10,50; 10,25; 10,7510,5±0,250,05 М трис-буфер8,511,25; 11,50; 11,2511,48±0,14

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа концентрации вирусов из жидких сред. Способ включает адсорбцию вируса на гидрогеле метакриловой кислоты в концентрации не менее 2,0 мг/мл, сорбции при рН 5,0 от 20 минут до 24 часов при температуре от 4°С до 22°С и далее комплекс вирус-сорбент центрифугируют и вирус элюируют. Преимущество изобретения заключается в сокращении числа стадий и уменьшении времени концентрирования. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ концентрации вирусов в жидких средах, включающий сорбцию вирусов из жидких сред на сорбенте в течение временного интервала с последующим отделением комплекса вирус + сорбент центрифугированием и элюцией вирусов, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют гидрогель метилкремневой кислоты в концентрации не менее 2 мг/мл сорбента, сорбцию проводят при рН 5,0 от 20 мин до 24 ч при температуре от +4 до +22°С.2. Способ концентрации вирусов по п.1, отличающийся тем, что используют гидрогель метилкремниевой кислоты, в концентрации не менее 30,0 мг/мл, который обладает способностью адсорбировать не менее 96% вирусных частиц из водных сред, при рН 5,0.