Штамм полиовируса типа П,используемый для исследования объектов окружающей среды Советский патент 1988 года по МПК C12N7/00 

(21)4143138/28-13

(22)16.06.86

(46) 30.06.88. Бюл. № 24

(71)Молдавский научно-исследовательский институт гигиены и эпидемиологии

(72)К.И.Спыну и В.П.Вуткарев

(53)576.858 (088.8)

(56)Авторское свидетельство СССР №1352945, кл. С 12 N 7/00,06.01.86.

(54)ШТАММ ПОЛИОВИРУСА ТИПА П, ИС- . ПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

(57)Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при оценке биогенного загрязнения энтеровирусами объектов внешней среды. Цель изобретения - повышение длительности выживания маркированного вируса в объектах окруда- ющей среды. Штамм полиовируса получен из вакционного вируса полиомиелита путем по.следовательных пассажей при нарастающем температурном режиме от 37 до . Депонирован под номером пев 1935. В пробах воды маркированный вирус обнаруживается до 75 дней.

«и

С

а

Сл

00

Изобретение относится к медицине-, кой вирусологии и может быть использовано при оценке биогенного загрязнения знтеровирусами объектов внешней средь, в частности для изучения длительности выживаемости кишечных вирусов в водных объектах, воздухе, пищевых продуктах.

Цель изобретения - повышение длительности выживания маркированного вируса в объектах окружающей среды.

Штамм получен из вакцинного 1 вируПатогенные свойства. Штамм горяса полиомиелита Р-712 ck.2aB, которьи

культивируют в фибробластах эмбриона 5 чий вариант полиовируса типа П являчеловека в серии последовательных ется безопасным для человека, не палассажей (в количестве 26), при нара- тогенным для мышей при внутримозгостающем температурном режиме от 37

до 42 С, а затем для закрепления повом, внутримьш1ечном, внутрибрюшинном

и подкожном введении. Специфичность горячего - варианта полиовируса показана в реакции нейтрализации на культуре клеток фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ) при 42°С с использованием иммунной кроличьей сыворотки, полученной к этому варианту вируса полиомиелита, которая в разведении 1:32 ингибирует 1000 вируса. Пример. Получение и использолученного варианта прово дят 25 пас- сажей в культуре клеток при 42 С.

Штамм - горячий вариант полиовируса типа П депонирован под номером ГКВ 1935 и хранится в коллекции Института вирусологии им. Д.И.Иванове- кого АМН СССР.

Штамм - горячий вариант полиови

руса типа П характеризуется следующми признаками.

Морфологические признаки. Структ ра типична для энтеровирусов. По даным электронно-микроскопических исследований вирионы имеют сферическу форму с диаметром 20-21 им.

Физико-химические свойства. Усточив к 20,0%-ному эфиру в течение 18 ч, размножается в присутствии 50 мкг/мл 5 бром-2-дезоксиуридина, устойчив при рН 3,0-6,0; плавучая плотность в растворах хлорида цезия равна 1,34 г/см, коэффициент седи- ментапии 150-165, задерживается при фильтрации на поверхности миллипоро вых фильтров типа с диаметром пор 0,22 р( м.

Для выращивания указанной первич- но-трипсинизированной культуры ис- д5 пользуют среду 199 с 10,0% сыво- ротки крупного рогатого скота. Вирус вносят на монослой клеток ФЭЧ после удаления .среды из расчета 0,2 мл на 250000 клеток и после часового контакта культуру заливают средой 199 и инкубируют при в течение 6 дней до наступления деструктивных изменений клеток.

Вирусосодержащий материал подверКультуральпые свойства. Штамм характеризуется высокими показателями репродукционной активности в культуре клеток, в том числе в ФЗЧ. Уровень - размножения полученного варианта вируса в культуре клеток составляет 6,5-7,0 Ig . Температурньй режим культивирования 42 С обеспечивает максимальный выход вирусных час- гают 3-кратному замораживанию и отта- тиц горячего варианта, тогда как иванию в смеси сухого льда со спир- энтеровирусы, в том числе исходный штамм Р-712 ck 2ав, не способны репродуцироваться при этой температуре.

том. Собранную жидкость центрифугируют 20 мин при 4000 об/мин для удаления клеточного дентрита. Затем мате

Стабильность биологических свойств. Стабильность биологических свойств показана при 25-кратном пассировании полученного штамма в культуре клеток ФЭЧ при .

Антигенные свойства. Изучение антигенной структуры в реакции диффузионной преципитации в геле с помощью штаммоспецифических сывороток к по- лиовирусам показало сходство со штаммом Р-712 ck 2ав (вакцинный, штамм вируса полиомиелита).

Патогенные свойства. Штамм горявом, внутримьш1ечном, внутрибрюшинном

и подкожном введении. Специфичность горячего - варианта полиовируса показана в реакции нейтрализации на культуре клеток фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ) при 42°С с использованием иммунной кроличьей сыворотки, полученной к этому варианту вируса полиомиелита, которая в разведении 1:32 ингибирует 1000 вируса. Пример. Получение и использование горячего варианта штамма по

лиов1 руса типа П.

Горячий вариант вируса полиомиелита типа П, прошедший контроль на стерильность, биологическую активность, безвредность для белых мьш1ей, разводили в 10 на питательных средах (среда 199, Игла, 0,5%-ный гид- ролизат лактальбумина на растворе Хенкса, содержащих антибиотики-пени- циллин 200,0 ЕД/мл, стрептомицин

1005,0 мкг/мл). Затем маркированный вирус накапливали в культуре ФЭЧ при 42°С.

Для выращивания указанной первич- но-трипсинизированной культуры ис- пользуют среду 199 с 10,0% сыво- ротки крупного рогатого скота. Вирус вносят на монослой клеток ФЭЧ после удаления .среды из расчета 0,2 мл на 250000 клеток и после часового контакта культуру заливают средой 199 и инкубируют при в течение 6 дней до наступления деструктивных изменений клеток.

Вирусосодержащий материал подвергают 3-кратному замораживанию и отта- иванию в смеси сухого льда со спир-

гают 3-кратному замораживанию и отта- иванию в смеси сухого льда со спир-

том. Собранную жидкость центрифугируют 20 мин при 4000 об/мин для удаления клеточного дентрита. Затем материал проверяют на присутствие цито- патогенного вируса путем титрования его в культуре клеток при А2 С. Титр вируса составляет 6,5 Ig .

Подготовленный и проконтролированный на стерильность и биологическую активность; маркированньщ вирус вносили в водопроводную воду. Вносимое количество горячего варианта полио- вируса типа П позволяет искусственно создать концентрацию 5,0 Ig ЩЩг /мл. Воду выдерживают при 25°С. Через определенные интервалы времени (2,4, 6,8,10,12,24 ч, 2,4,6,10,15,30,45, 60,70,75,80,85,90 сут) производят отбор проб воды в объёме 1,0 мл.

Выделение индикаторного вируса проводят в ФЭЧ при температурном режиме 42 С. Количественный подсчет вируса осуществляют по методу Рида- Менча при такой же температуре.

Анализ полученных результатов позволяет установить, что титр горяче

5

0

5

го варианта вируса полиомиелита за

5 ч снижается на 0,3 Ig ЦГЩ /мп,

что указывает на его период полужизни.

Обнаружение маркированного вируса в пробах воды до 75-го дня после его внесения в воде указывает на длительность его выживания в водопроводной воде при 25°С.

Возможность использования штамма полиовируса типа П при исследовании объектов внешней среды определяется его высокой репродуктивностью в культуре клеток при , тогда как известный штамм размножается в культуре клеток только при . Кроме того, данный штамм можно в отличие от холодного варианта использовать круглый год в жарких районах.

Форму.ла изобретения

Штамм поливируса типа П, ГКВ 1935, используемый для исследования объектов окружающей среды.