СПОСОБ ОЦЕНКИ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области клинической иммунологии и может быть использовано для определения иммунного статуса человека. Цель изобретения -упрощение способа оценки фагоцитарной активности нейтрофилов за счет использования принципиально новых объектов фагоцитоза. Необходимость проведения подобных исследований закреплена в «Номенклатуре клинических лабораторных исследований» (п. 6.15.5. - Признаки реактивности нейтрофилов), утвержденной Приказом Министерства здравоохранения РФ №64 от 21.02.2000 г.

Способ направлен на исследование фагоцитарной активности клеток периферической крови человека с использованием пегилированных наночастиц оксида графена в качестве объектов фагоцитоза. Заявляемый способ предназначен для использования в лабораториях биологического и медицинского профиля, решающих вопросы оценки иммунного статуса организма с целью выявления их возможных нарушений и контроля эффективности соответствующей терапии. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов оценки неспецифического иммунитета.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов крови предназначен для диагностики нарушений врожденного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях организма. Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови является важным диагностическим показателем в лабораторно-клинической практике. Изменение фагоцитарной активности клеток может быть ассоциировано с серьезными нарушениями в работе иммунной системы, а именно, быть маркером врожденного или транзиторного дефицита фагоцитоза [19].

Существует множество методов оценки фагоцитарной активности клеток, основанных на поглощении различных корпускулярных объектов. Известно три основных способа фиксации результатов фагоцитоза: с помощью микроскопии, при помощи оценки биолюминесценции или флуоресценции на соответствующей приборе и с помощью проточной цитометрии. В первом способе могут использоваться как световые и люминесцентные микроскопы, так и новейшие разработки с очень высоким разрешением, например, мультилазерные конфокальные микроскопы. В качестве объектов фагоцитоза могут использоваться бактерии и грибки (живые и фиксированные), а такжеформалинизированные эритроциты барана, латексные частицы и полистерольные микросферы различных размеров.

Первый метод оценки предлагает реакцию фагоцитоза проводить в цельной крови (капле), а регистрацию результатов фиксировать с помощью светового микроскопа. Однако, очевидно, что подсчет клеток на препаратах имеет свои ограничения, связанные с временными затратами, а также относительно низкой точностью метода и существенным уровнем субъективизма.

Известен ряд объектов фагоцитоза для данного метода: латексные частицы [4], Staphylococcus epidermidis штамм 9198 [5], Saccharomyces cerevisiae [9] и опсонизированные частицы зимозана [3].

Существует способ оценки фагоцитоза, где в качестве объектов используется бактерии модифицированного штамма E.Coli BL21(DE3), синтезирующие зеленый флуоресцентный белок [11], авторы предлагают использовать микроскопический подсчет клеток в люминесцентном микроскопе.

Также известен способ оценки фагоцитоза с применением прибора, измеряющего люминесценцию, где в качестве объектов используются бактерии генно-инженерного штамма E.coli lux+. Данные бактерии обладают способностью к биолюминесценции, которая фиксируется при помощи биолюминометра и в процессе их поглощения нейтрофилами периферической крови человека значительно снижается [6]. Существует аналогичный метод, где в качестве объектов фагоцитоза используется Е. coli с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi [7]. В качестве объектов фагоцитоза могут быть бактерии клинического штамма метицилленрезистентного Staphylococcus aureus, что позволяет проводить хемилюминесцентный анализ функциональной активности лейкоцитов крови [8].

Разделить типы объектов фагоцитоза по способам оценки результата крайне сложно, так как поглощение бактерий с геном люминесценции можно оценить, как микроскопически, так и на биолюминометре и на проточном цитофлуориметре [10]. Недостатки данного способа фиксации результатов фагоцитоза заключаются в том, что оценивается общий пул клеток, по суммарной био/хемолюминесценции без анализа конкретных клеток. Недостатки ряда способов оценки фагоцитоза, основанных на подсчете мазков или фиксации роста колоний на чашках Петри очевидны субъективизм и недостаточная выборка клеток в сравнении с проточным цитофлуориметром, который позволяет быстро оценивать до 100 000 клеток в пробе.

Для проточной цитометрии в качестве мишеней фагоцитоза используют различные субстраты с флуоресцентными метками (например, FITC), такие как зимозан ификсированные микроорганизмы: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Haemophilus influenzae [1, 16]. Недостатком способа является необходимость различать диспергированные и агломератные состояния клеток и используемые объекты фагоцитоза [14].

Также стоит отметить, что использование в качестве объектов фагоцитоза бактериальных клеток сопряжено с необходимостью их культивирования, и постоянной оценки их свойств: биолюминесценция, хемилюминесценция, контроль сохранности метки и наличие агрегатов.

Обоснование выбора наночастиц оксида графена

Препараты на основе графена являются одними из самых перспективных материалов в биомедицине. В биологических и медицинских исследованиях преимущественно применяются окисленные формы графена, а именно оксид графена (ОГ) [12].

В то же время, покрытие наночастиц биосовместимыми полимерами, из которых самым привлекательным является полиэтиленгликоль (ПЭГ), существенно снижает цитотоксичность ОГ [13]. В работе использовались наночастицы ОГ размерами 1-5 мкм («Ossila Ltd», Великобритания), которые покрывали линейным полиэтиленгликолем (П-ОГ) методом ковалентной пришивки аминогрупп ПЭГ-NH₂ к поверхностным карбоксильным группами ОГ с образованием амидной связи [15]. Оксид графена обладает собственной флуоресценцией [17], поэтому наночастицы использовались как объекты фагоцитоза без каких-либо дополнительных меток.

Наиболее близким к заявляемому решению по технической сущности и достигаемому результату является способ, основанный на поглощении флуоресцентно меченых бактерий Staphylococcus aureus, [2] который позволяет количественно определить фагоцитарную активность нейтрофилов. В данном случае измеряют долю клеток фагоцитов, поглотивших бактерии. Для проведения анализа используютгепаринизированную цельную кровь, в которую добавляют флуоресцентно меченые бактерии Staphylococcus aureus и инкубируют при 37°С. Отрицательный контроль оставляют на льду, поскольку холод препятствует поглощению частиц субстрата. Фагоцитоз останавливают, помещая образцы на лед, и добавляют реагенты для гашения флуоресценции, позволяющие провести дискриминацию между прилипшими и интернализованными бактериями. При этом подавляется флуоресценция бактерий, прилипших к поверхности фагоцитов, и остается флуоресценция поглощенных.

С позиции критики описанного способа стоит отметить, что использование микроорганизмов (как меченных красителем, так и генномодифицированных) требует предварительного этапа, связанного с культивированием микроорганизмов, что, несомненно, делает тесты на фагоцитоз более дорогостоящими и технологическими сложными. Если в анализе используются корпускулярные частицы (зимозан, латексные микросферы и т.д.), меченные красителем (FITC), то важно контролировать сохранность метки. Наночастицы оксида графена в этом плане довольно простой корпускулярный объект фагоцитоза, очевидно, что аутофлуоресценция в лазерном луче проточного цитофлуориметра является природным свойством графена.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа анализа фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека с использованием пегилированных наночастиц оксида графена.

Технический результат от использования заявляемого способа оценки фагоцитарной активности нейтрофилов заключается в сокращении времени и трудоемкости проводимого исследования.

Технический результат достигается за счет применение в качестве объектов фагоцитоза пегилированных наночастиц оксида графена, обладающих аутофлуоресценцией как природным качеством.

Сущность способа заключается в том, что нейтрофилы периферической крови человека, полученные методом седиментации, инкубируют в течении 30 минут с пегилированными наночастицами оксида графена в концентрации 25 мкг/мл, после чего на проточном цитофлуориметре оценивают количество клеток, поглотивших наночастицы, по параметрам аутофлуресценции графена.

При этом исключается стадия подращивания биомассы, как в случае применения бактерий, нет необходимости вводить в структуру фагоцитируемого объекта флуоресцентную метку, так как частицы оксида графена обладают собственной флуоресценцией.

Заявляемый способ предполагает использование наночастиц оксида графена в качестве объектов фагоцитоза, благодаря чему, можно получить данные об иммунном статусе клеток с помощью их анализа на проточном цитометре. Преимуществами данного способа является использование более точных методов клеточного анализа (проточная цитометрия), а также современного материала - оксида графена; упрощение технологии и сокращение времени, необходимого для исследования. Наночастицы оксида графена обладают собственной флуоресценцией, благодаря этому они детектируются проточным цитометром без дополнительных флуресцентных меток [17].

Поглощение корпускулярных частиц, в том числе и наночастиц ОГ, отражается на размере клеток и их гранулярности, что также может служить показателем фагоцитарной активности [Timganova V., Zamorina S., Bochkova M., Nechaev A., Khramtsov P., Shardina, K. Uzhviyuk S., and M. Rayev. The Effect of Pristine and Pegylated Graphene Oxide Nanosheets on the Functions of Human Neutrophils // KnE Life Sciences, 2022, P. 48-57. DOI 10.18502/kls.v7il.10105]. Однако, данные параметры (размер, гранулярность) изменяются при поглощении любых корпускулярных объектов фагоцитоза, при этом не учитывается уникальное природное свойство оксида графена аутофлуоресценция, Помимо этого, нейтрофилы являются гранулярными клетками, и поэтому необходим независимый параметр оценки фагоцитоза.

Признаки способа, отвечающие критерию новизны, состоят в том, что предлагаемый способ впервые предполагает использовать наночастицы оксида графена в качестве объекта фагоцитоза.

Представленная работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия малых форм предприятий в научно-технической сфере (программа «УМНИК»).

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Все процедуры проводят в ламинарных шкафах II класса биологической защиты с использованием стерильной одноразовой посуды и реагентов.

Объекты исследования. В работе использовали гепаринизированную кровь условно здоровых доноров (n=6, 35±7). Лейкоциты выделяли в стерильных условиях спонтанной седиментацией в течение 40 минут при t 37°С. Эритроциты осаждали, а сыворотку с оставшимися в ней клетками отделяли. Далее клетки отмывали от сыворотки двукратным центрифугированием при 350g в течение 15 минут при помощи питательной среды RPMI 1640 (Sigma, США). Из общего пула выделенных лейкоцитов осуществляли подсчет только нейтрофилов в камере Нейбауэра и доводили их концентрацию до 4* 10⁶ клеток в мл. Все манипуляции проводили при 4°С. Аутологичную сыворотку получали извенозной крови условно здоровых доноров. Сыворотку осветляли центрифугированием 4°С, 2700 g в течение 10 минут.

Подготовка наночастиц графена. Для оценки поглощения частиц клетками использовали П-ОГ в концентрации 25 мкг/мл. Разведения частиц готовили с использованием среды RPMI 1640, содержащей 20% аутологичной сыворотки. Аутологичную сыворотку использовали для опсонизации.

Фагоцитоз оценивали следующим образом: неспецифическое связывание, адгезию (при +4°С) и поглощение, фагоцитоз при 37°С. Смешивали 50 мкл суспензии наночастиц графена с 50 мкл разведенных клеток. В качестве контроля в пробу вместо графена добавляли 50 мкл среды RPMI 1640. Готовые пробы помещали на 30 минут в термостат на 37°С, аналогичные пробы - в холодильник +4°С на 30 минут. Затем фагоцитоз и/или адгезию останавливали добавлением 2 мл холодного фосфатно-солевого буферного раствора без магния и кальция -DPBS (Gibco, США) содержащего 0,5% BSA с последующей отмывкой в течение 10 минут +4°С 350g. Затем пробы ресуспендировали в 2 мл DPBS с 0,5% BSA. Оценка поглощения наночастиц П-ОГ производилась с помощью проточной цитометрии с использованием CytoFlex (Beckman Coulter, США). Для анализа применяли программное обеспечение KALUZA Analysis Software (Beckman Coulter, США). Для каждой пробы было получено не менее 100 000 событий. События получали в линейном режиме для FSC (размер) и SSC (гранулярность). Для оценки количества клеток, поглотивших частицы оксида графена, нейтрофилы отображали на гистограмме интенсивности флуоресценции по каналу для флуоресцентного красителя РЕ-Су7 (РС7), предварительно установив линейный гейт справа от пика аутофлуоресценции клеток в культуре без GO (Фиг. 1). Для выражения результатов, общую флуоресценцию в пробе делили на число клеток в пробе, получая показатель средней флуоресценции на клетку (отн. ед.).

На серии экспериментов (n=6) было показано, что нейтрофилы активно поглощают наночастицы П-ОГ в концентрации 25 мкг/мл, при этом контроль (без П-ОГ) находился в районе нуля по каналу флуоресценции РС7, в то время как клетки, поглотившие наночастицы ОГ, имели высокий показатель флуоресценции, который отображает поглощенные частицы (Фиг. 2). Стоит особо остановиться на способе расчета данных показателей общую флуоресценцию оценивали как при 4°С, считая данный показатель адгезией, а не активным фагоцитозом, а также при 37°С, считая данный показатель суммарным для адгезии и фагоцитоза. Из показателей при 37°С отнимали показатели 4°С, получая, таким образом, параметры «истинного» фагоцитоза.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Сущность заявляемого изобретения поясняется графическими изображениями.

На фигуре 1 представлены гистограммы аутофлуоресценции нейтрофилов периферической крови человека, в сравнении с флуоресценцией наночастиц П-ОГ по каналу для флуоресцентного красителя РЕ-Су7. По оси X - флуоресценция РС7-А, по оси У число событий (Count). Данные представлены в виде медианы значений экспериментальной серии (n=6).

На фигуре 2 представлены данные серии экспериментов, отражающих среднюю интенсивность флуоресценции в пробах с наночастицами П-ОГ при 4 и 37°С (n=6, M(Q1-Q3)). По оси X представлены показатели флуоресценции по каналу РС7 на одну клетку в отн. ед. Данные при 4°С интерпретируются как адгезия, при 37°С как суммарная адгезия и фагоцитоз. Данные «истинного фагоцитоза» представлены как разница между этими показателями.

На фигурах 3 а-г представлены дот-плоты и тактика гейтирования оценки аутофлуоресценции П-ОГ в гейте нейтрофилов после 30 минут инкубирования клеток с наночастицами в концентрации 25 мкг/мл на примере одного эксперимента при 4°С (адгезия):

3а Дот-плот, отражающий гейтирование нейтрофилов по параметрам прямого (FSC, ось X) и бокового (SSC, ось У) светорассеяния;

3б - Дот-плот, отражающий гейтирование пула одиночных клеток по параметрам (FSC, ось X) и бокового (SSC, ось У) светорассеяния;

3в Гистограмма, отражающая уровень флуоресценции по каналу РС7-А (ось X) в контрольной пробе (без П-ОГ), по оси У представлено число событий (Count);

3г - Гистограмма, отражающая уровень флуоресценции по каналу РС7-А (ось X) в пробе с наночастицами П-ОГ в концентрации 25 мкг/мл, по оси У представлено число событий (Count).

На фигурах 4 а-г представлены дот-плоты и тактика гейтирования оценки аутофлуоресценции П-ОГ в гейте нейтрофилов после 30 минут инкубирования клеток с наночастицами в концентрации 25 мкг/мл) на примере одного эксперимента при 37°С (адгезия+фагоцитоз):

4а - Дот-плот, отражающий гейтирование нейтрофилов по параметрам прямого (FSC, ось X) и бокового (SSC, ось У) светорассеяния;

46 Дот-плот, отражающий гейтирование пула одиночных клеток по параметрам (FSC, ось X) и бокового (SSC, ось У) светорассеяния;

4в - Гистограмма, отражающая уровень флуоресценции по каналу РС7-А (ось X) в контрольной пробе (без П-ОГ), по оси У представлено число событий (Count);

4 г - Гистограмма, отражающая уровень флуоресценции по каналу РС7-А (ось X) в пробе с наночастицами П-ОГ в концентрации 25 мкг/мл, по оси У представлено число событий (Count).

Предлагаемое техническое решение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

В работе использовали гепаринизированную кровь условно здорового донора. Лейкоциты выделяли в стерильных условиях спонтанной седиментацией в течение 40 минут при t 37°С. Эритроциты осаждали, а сыворотку с оставшимися в ней клетками отделяли. Далее клетки отмывали от сыворотки двукратным центрифугированием при 350g в течение 15 минут при помощи питательной среды RPMI 1640 (Sigma, США). Из общего пула выделенных лейкоцитов осуществляли подсчет только нейтрофилов в камере Нейбауэра и доводили их концентрацию до 4* 10⁶ клеток в мл. Все манипуляции проводили при 4°С. Аутологичную сыворотку получали из венозной крови условно здоровых доноров. Сыворотку осветляли центрифугированием 4°С, 2700 g в течение 10 минут.

Для оценки поглощения частиц клетками использовали П-ОГ в концентрации 25 мкг/мл. Разведения частиц готовили с использованием среды RPMI 1640, содержащей 20% аутологичной сыворотки.

Фагоцитоз оценивали следующим образом: неспецифическое связывание, адгезию (при 4°С) и поглощение, фагоцитоз при 37°С.Смешивали 50 мкл суспензии наночастиц П-ОГ с 50 мкл разведенных клеток. В качестве контроля в пробу вместо графена добавляли 50 мкл среды RPMI 1640. Готовые пробы помещали на 30 минут в термостат на 37°С, аналогичные пробы - в холодильник +4°С на 30 минут. Затем фагоцитоз и/или адгезию останавливали добавлением 2 мл холодного фосфатно-солевого буферного раствора без магния и кальция -DPBS (Gibco, США) содержащего 0,5% BSA с последующей отмывкой в течение 10 минут 4°С 350g. Затем пробы ресуспендировали в 2 мл DPBS с 0,5% BSA. Оценка поглощения наночастиц П-ОГ производилась с помощью проточной цитометрии. Все исследования проточной цитометрии выполнялись с использованием CytoFlex (Beckman Coulter, США). Для анализа применяли программное обеспечение KALUZA Analysis Software (Beckman Coulter, США). Для каждой пробы было получено не менее 100 000 событий. События получали в линейном режиме для FSC (размер) и SSC (гранулярность).

В первую очередь гейтировали нейтрофилы по параметрам FSC и SSC, затем выделяли одиночные клетки. Для оценки количества клеток, поглотивших частицы П-ОГ, нейтрофилы отображали на гистограмме интенсивности флуоресценции по каналу дляфлуоресцентного красителя РЕ-Су7 (РС7), предварительно установив линейный гейт справа от пика аутофлуоресценции клеток в культуре без П-ОГ. На фигурах 3А-3Г показано, что при 4°С уровень адгезии П-ОГ составлял 5,9% клеток среди пула нейтрофилов. Однако, при 37°С (фигуры 4А-4Г) количество клеток, обладающих аутофлуоресценцией в спектре графена (РС7) возрастало до 24,44%. Этот показатель интерпретируется как сумма адгезии и фагоцитоза. Таким образом, показатель «истинного фагоцитоза» принимается как разница между этими показателями и равняется 24,44 5,9=18,5%.

Таким образом, технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается, в том, что применение частиц графена в качестве объектов фагоцитоза нейтрофилами существенно сокращает время и трудоемкость проводимого исследования, снижая при этом себестоимость анализа, за счет природных свойств самих частиц. Исключается стадия подготовки бактериальной биомассы. Последнее является необходимым условием реализации метода, основанного на применении в качестве объекта фагоцитоза бактерий и занимает, как правило, не менее 24 часов [Коленчукова О.А., Беленюк В.Д. Активность фагоцитов в ответ на воздействие штаммов Staphylococcus aureus, устойчивых к действию метициллина // Антибиотики и химиотер. 2022; 67: 12: 4 8. doi: 10.37489/0235-2990-2022-67-1-2-4-8.]. Время- и трудозатратная процедура введения в структуру фагоцитируемого объекта флуоресцентной метки так же отсутствует в предлагаемом способе в силу того, что частицы оксида графена обладают собственной флуоресценцией. Предложенный способ объективно не зависит от необходимости применять дорогостоящие реагенты, оксид графена надежно доступен. Ранее мы уже применяли наночастицы ОГ как объекты фагоцитоза, но по отношению к другому типу клеток - периферические моноциты человека [Khramtsov Р, Bochkova М, Timganova V, Nechaev A, Uzhviyuk S, Shardina К, Maslennikova I, Rayev M, Zamorina S. Interaction of Graphene Oxide Modified with Linear and Branched PEG with Monocytes Isolated from Human Blood//Nanomaterials (Basel). 2021, 12(1), 126. doi.org/10.3390/nanol2010126]. Поглощение П-ОГ моноцитами оценивали с помощью проточной цитометрии путем измерения флуоресценции графеновых наночастиц в канале Су7. Было показано, что наночастицы П-ОГ в концентрации 25 мкг/мл являются адекватными объектами фагоцитоза.

Разработанный способ оценки фагоцитоза показал свою эффективность, нейтрофилы активно поглощали П-ОГ, а продемонстрированные способы расчета результатов оценки фагоцитарной активности позволяют применять данный способ как в клинико-диагностической практике, так и в научных исследованиях.

Библиографический список:

1. Акинфиева, О.В. Применение проточной цитофлуорометрии для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека / О.В. Акинфиева, Л.Н. Бубнова // Вестник гематологии. 2010. Т. 6, №1. С.11.

2. Анализ функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови методом проточной цитофлюориметрии у здоровых доноров / И.И. Долгушин,

B.А. Маркова, С.В. Квятковская [и др.] // Российский иммунологический журнал. 2014. - Т. 8, №3(17). - С. 305-307.

3. Патент №2089899 С1 Российская Федерация, МПК G01N 33/48. Способ оценки фагоцитарной активности моноцитов крови человека: №94016319/14: заявл. 05.05.1994: опубл. 10.09.1997 / В.А. Извекова, В.Ф. Учайкин.

4. Патент №2105975 С1 Российская Федерация, МПК G01N 33/48. Способ определения фагоцитарной активности периферической крови: №92009138/14: заявл. 30.11.1992: опубл. 27.02.1998 / Т.Г. Дедова, Е.М. Иванов, А.В. Кретов, В.Н. Потапов; заявитель Институт медицинской климатологии и восстановительного лечения СО РАМН.

5. Патент №2242763 С1 Российская Федерация, МПК G01N 33/53. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови живых организмов: №2003107776/15: заявл. 12.03.2003: опубл. 20.12.2004 / Е.С. Нишева, А.Н. Галустян; заявитель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия.

6. Патент №2292553 С1 Российская Федерация, МПК G01N 33/53. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека по степени гашения биолюминесценции: №2005118124/15: заявл. 10.06.2005: опубл. 27.01.2007 / C.В. Ширшев, Е.М. Куклина, С.А. Заморина [и др.]; заявитель Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук (ИЭГМ УрО РАН).

7. Патент №2366953 С2 Российская Федерация, МПК G01N 33/487, G01N 33/53. Биохемилюминесцентный способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов: №2007139351/15: заявл. 23.10.2007: опубл. 10.09.2009 / Д.Г. Дерябин, И.Ф. Каримов; заявитель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования ”Оренбургский государственный университет”.

8. Патент №2445626 С1 Российская Федерация, МПК G01N 33/487, G01N 33/52. Способ определения функциональной способности фагоцитирующих клеток: №2011107691/15: заявл. 28.02.2011: опубл. 20.03.2012 / О.В. Теплякова, Ю.С. Винник, А.А. Савченко [и др.]; заявитель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования ”Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации”.

9. Патент №2727880 С1 Российская Федерация, МПК G01N 33/48, C12Q 1/02. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов при помощи микробиологического подхода: №2019130936: заявл. 30.09.2019: опубл. 24.07.2020 / Н.В. Богачева, Н.А. Тунева; заявитель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования “Кировский государственный медицинский университет” Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Кировский ГМУ Минздрава России).

10. Применение проточной цитометрии в иммунодиагностике / Д.В. Мазуров, С.В. Дамбаева, С.В. Климова [и др.] // Медицинская иммунология. 2002. Т. 4, №4-5. С. 507-514.

11. Райхерт, Е. А. Способ определения фагоцитарной активности на основе флуоресцирующих бактерий / Е. А. Райхерт // Образовательная система: вопросы теории и практики: сборник научных трудов. Казань: ООО “СитИвент”, 2019. С.374-377.

12. Dreyer D.R., Park S., Bielawski C.W., Ruoff R.S. The chemistry of graphene oxide. Chem Soc Rev. 2010, V. 39(l), P. 228-40.

13. Jia J., Zhang Y., Xin Y., Jiang C, Yan В., Zhai S. Interactions Between Nanoparticles and Dendritic Cells: From the Perspective of Cancer Immunotherapy. Front. Oncol. 2018, V. 8, P. 404. doi: 10.3389/fonc.2018.00404.

14. Mutzke E., Chomyshyn E., Nguyen K.C., Blahoianu M, Tayabali AF. Phagocytosis-coupled flow cytometry for detection and size discrimination of anionic polystyrene particles. Anal Biochem. 2015, V. 483, P. 40-46. doi: 10.1016/j.ab.2015.04.034.

15. Nechaev A.I., Khramtsov P.V., Zamorina S.A. Polyethylene glycol-based modification of graphene oxide В сборнике: AIP Conference Proceedings. Proceedings of the International Scientific Conference. AIP PUBLISHING, 2022. C. 020054.

16. Piatt N, Fineran P. Measuring the phagocytic activity of cells. Methods Cell Biol. 2015, V. 126, P. 287-304. doi: 10.1016/bs.mcb.2014.10.025.

17. Singh S.K., Singh M.K., Nayak M.K., Kumari S., Gra'cio J.J.A., Dash D. Characterization of Graphene Oxide by Flow cytometry and Assessment of Its Cellular Toxicity. Carbon. 2011, V. 49(2), P. 684-692.

18. Uribe-Querol E. and Rosales C. Phagocytosis: Our Current Understanding of a Universal Biological Process. Front. Immunol. 2020, V. 11, P.1066. doi: 10.3389/fimmu.2020.01066.

Изобретение относится к области клеточной биотехнологии. Раскрыт способ оценки фагоцитарной активности клеток, заключающийся в совместной инкубации клеток нейтрофилов, при температуре 37°С с объектами фагоцитоза, что приводит к поглощению последних фагоцитирующими клетками, с последующей оценкой результата на проточном цитофлуориметре, при этом в качестве объектов фагоцитоза используют пегилированные наночастицы оксида графена в концентрации 25 мкг/мл, а результат фагоцитоза оценивают по числу клеток, поглотивших аутофлуоресцирующие частицы при 37°С в процентах от общего числа проанализированных клеток, за вычетом процента флуоресцирующих клеток, проинкубированных с наночастицами пегилированного оксида графена при 4°С. Изобретение обеспечивает сокращение времени и трудоемкости проводимого исследования. 10 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ оценки фагоцитарной активности клеток, заключающийся в совместной инкубации клеток нейтрофилов, при температуре 37°С с объектами фагоцитоза, что приводит к поглощению последних фагоцитирующими клетками, с последующей оценкой результата на проточном цитофлуориметре, отличающийся тем, что в качестве объектов фагоцитоза используют пегилированные наночастицы оксида графена в концентрации 25 мкг/мл, а результат фагоцитоза оценивают по числу клеток, поглотивших аутофлуоресцирующие частицы при 37°С в процентах от общего числа проанализированных клеток, за вычетом процента флуоресцирующих клеток, проинкубированных с наночастицами пегилированного оксида графена при 4°С.