Способ микроклонального размножения карельской березы Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и касается создания лесньк культур плантационного типа.

Целью изобретения является упрощение процесса культивирования, по- вьшение выхода размножаемого материала и повьшение его генетической стабильности.

Способ состоит в том, что на среде Мурасиге-Скуга с фитогормонами (2,4-Д 0,5-3,0 мг/л; БАП 0,5 мг/л) в темноте и при инкубируют межузловые стеблевые сегменты до образования на них сплошного (нли участками) слоя каллуса, который затем срезают и рекультивируют на свежей среде Мурасиге-Скуга с БАП 1 мг/л в контролируемых условиях (освещенность 3-4 клк в течение 24 ч при 25-26 0) до формирования адвентивных почек, которые при повторной пересадке культур формируются в побеги. Последние изолируют из каллуса, укореняют и доращивают на среде Буле без гормонов в тех же контролируемых условиях. Полученные регенеранты разрезают на микрочеренки с одной почкой и снова выращивают на той же среде. Процесс микрочеренко- Ьания повторяют несколько раз до получения необходимого количества растений, которые затем высаживают в горшочки с субстратом (торф и песок), доращивают в минитепли- цах в течение 2-4 мес с постепенным снижением влажности до естественной величины и переносят в .плеcm

х |

00

05

ночные теплицы для закаливания до конца вегетационного периода.

На следующей схеме представлены все этапы клонального микроразмножения карельской березы...

Изобретение относится к биотехнологии и касается микроклонального размножения растений, в частности древесной культуры - карельской березы. Цель изобретения - упрощение процесса культивирования, повышение выхода размножаемого материала и повышение его генетической стабильности. Способ состоит в том, что стеблевые эксплантаты помещают на модифицированную среду Мурасиге-Скуга, получают на ней каллус и побеги, которые переносят на безгормональную среду Буле, где получают регенеранты и проводят их мультипликацию путем последовательного и многократного микрочеренкования. Затем размноженный материал высаживают в пленочные теплицы и открытый грунт. 1 табл.1 з.п.ф-лы.

Схема микроклонального размножения карельской березы:

Подготовка эксплантатов(стерилизация, удаление коры, сегментирование побе- гов)

Культивирование на питательной среде для каллусообразования (среда № 1)

4

Отделение каллуса от эксплантата, культивирование на среде для индукции побегов (среда № 2)

Изоляция побегов из каллуса, выращивание их на среде для роста и образования корней (среда № 3)

Микрочеренкованиё регенерантов и выращивание черенков на среде № 3 -

i Мультипликация черенковых растений

путем последовательного и многократного микрочеренкования на среду № 3

Способ клонального микроразмножения карельской березы осуществляют следующим образом.

Со взрослого дерева карельской березы (30 лет) срезают ветви и помещают в .воду до появления на них листьев. Далее отрезки побегов величиной 15-20 см протирают спиртом (96%), стерилизуют в 3%-ном растворе хлорамина в течение А5 мин, трижды промывают стерильной водой и после удаления с них коры разрезают на сегменты до 1-1,5 см каждый.

Питательные среды для каллусообразования (среда № 1) и индуцированного морфогенеза (среда № 2) готовят согласно прописи Мурасиге-Скуга. Исключение составляют: агар 0,6%; сахароза 2%; инозит 100 мг/л; аскорбиновая кислота 1 мг/л; глицин 2мг/л глютамин 0-25 мг/л| глютатион и гид- йр лизат казеина не используют. В качестве индукторов каллусообразования в среду № 1 вводят 2,4-Д в концентрации 0,5-3,0 мг/л и БАП 0,5 мг/л. Мор фоиндукторами в среде № 2 служат БАЛ и МУК в концентрациях соответственно

Перенос черенковых растений в субстрат, дора- щивание в минитеплицах при контролируемых условиях

5

0

0

5

Перенос растений в пленочную теплицу, доращи- вание, закаливание

1,0 и 0,1 мг/л. Среду для усиления роста и укоренения побегов (среда № 3) готовят согласно прописи Буле без добавления фитогормонов Все питательные среды стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 20 мин.

Простерилизованные сегменты помещают горизонтально на среду № 1 и инкубируют в темноте при 26 С. Через 2-4 нед. на стеблевых сегментах (эксплантатах) формируется каллус в виде сплошного слоя или отдельными участками. Эффективность каллусообразования на средах с разным содержанием 2,4-Д различна: минимальная при концентрации 0,5 мг/л (около 10% культур) и максимальная при 3 мг/л (100% культур). Образовав- щуюся каллусную ткань срезают и культивируют при контролируемых условиях: круглосуточное освещение при 25 - и освещенности 3-4 клк.

Через 4 нед. среди выращиваемых культур выделяют 3 типа каллусов: хорошорастущие желтого и равномерно- зеленого цвета и растущие несколько рсуже с плотными темно-зелеными участками. Каллусов последнего типа отмечается больше, если первичная среда № 1 содержит 2,А-Д в концентрации 0,5 мг/л, и значительно меньше если количество 2,4-Д составляет 3 мг/л. Повторное выращивание каллусов на среде № 2 приводит к образованию почек в культурах 3-го типа в количестве 5-10 шт. на одну культуру. Каллусы желтого и равномерно-зеленого цвета выраженных морфогенных признаков не проявляют и из дальнейших опытов исключены. Почки, индуцированные в каллусе, через 3-4 нед. формируются в побеги, которые при достижении 1-1,5 см изолируют, помещая на среду № 3. Процессы образования корней и роста побегов происходят одно- временно. Укорененные регенеранты величиной 4-6 см разрезают на узловые микрочеренки, которые также выращивают на среде № 3, Образовавшиеся черенковые растения вновь черенкуют и через 3-4 нед. из черенков получают новый материал, пригодный к следующему черенкованию. В условиях указанного режима проводят 4 цикла черенкования, на протяжении которых сохраняются 100%-ная укореняемость черенков и интенсивньш рост пазушных побегов. При первом цикле от каждого регене- ранта получают по 2-3 микрочеренка, при последующих - количество черенко от каждого растения увеличивается до 4-5, При изменении условий эксперимента: увеличении освещенности до 8- 9 клк и уменьшении фотопериода до 16 ч, отмечают заметное торможение роста и укоренения черенков.

Укрепленные черенковые растения высотой от 3 до 6 см извлекают из культуральных сосудов и высаживают в субстрат из торфа и песка (1:1), предварительно промытого ,и прокаленного. Растения доращивают при повышенной влажности воздуха в полиэтиленовых или пластмассовых минитепли- цах при контролируемом режиме в течение 1-4 мае. В пленочную теплицу в естественных условиях растения переводят в мае и июле, при этом высота их варьирует от 3 до 40 см в зависи-. мости от длительности доращивания в контролируемых условиях. Выживаемость растений к концу вегетационного периода составляет 100%.

Пример 1. В соответствии с приведенной методикой проводят

, .

10

15

20

597386

последовательно посадку эксплантатов на среду, получают растения-регене- ранты и проводят их клональную мультипликацию путем многократного к последовательного черенкования,, при этом, в питательную среду для каллусообра- зования вносят 0,5 мг/л 2,4-Дс При анализе полученного размножаемого растительного материала видно, что при высокой морфогенной активности не проявляется самоклональная изменчивость и отмечается 1001-ная жизнеспособность размножаемого материала.

Примеры 2иЗ. Аналогично примеру 1 используют 2,4-Д в концентрациях 2 и 3 мг/л, при этом отмечают более интенсивное каллусообразование, однако, вместе с тем, повышается вероятность сомаклональной изменчивости.

Показатели роста растений, высаженных в пленочную теплицу в разное время, представлены в таблице.

Использование предлагаемого способа клонального микроразмножения карельской березы обеспечивает по сравнению с известными способами следующие преимущества. Сочетание инду- зг, цированного морфогенеза в первичном каллусе с микрочеренкованием образующихся регенерантов позволяет размножать взрослые деревья с большой эффективностью и уменьшением или исключением вообще генетической вариабель- ности вегетативного потомства. Использование микрочеренкования на безгормональной среде Буле позволяет из ограниченного количества исходного материала за короткий срок получить массовое количество жизнеспособных растений. Согласно расчетам, полученным на основании проведенных экспериментов, из одного регенеранта за год можно получить более 1 млн. черенков растений. Внедрение способа в производство позволяет за короткий срок создать плантации карельской березы., обладающей наиболее выраженными декоративными свойствами древесины.

25

40

45

50

Формула изобретения

регенерантов, их мультипликацию, до- раир вание и Закаливание с последующей пересадкой в открытый грунт, о т- ли чающийся тем, что, с целью упрощения процесса культивирования , повьшения выхода размножаемого материала и повышения его генетической стабильности, в качестве эксплантатов используют стеблевые сегменты.

а получение регенерантов и их мультипликацию осуществляют на безгормональной среде Буле,

2, Способ по п. 1, отличаю- щ и и с я тем, что мультипликацию регенерантов проводят путем многократного и последовательного микрочеренкования.