П р и м е р 1. Способ отбора штаммов Escherichia coli - продуцентов антигена К8Н достоит из нескольких стадий: выделение антигена,получение радд оактивпомеченных: анти-К88 иммуноглобулинов, проверка специфичности меченн1 1Х иммуноглобулинов, измерение продукции антигена К88.
Выделение антигена К88.
Антиген К88 выделяют по методу Стирма, Клетки E.coli РМ1, выращенные при на питательном агаре, сгатают забуференным физиологическим раствором (0,15 М NaCl 0,04 М Na.2HPO,j ,рИ 7,4) и разводят до титра 4 X 10 кл/мл. Суспензию инкубируют 20 мин при 60 С, затем клетки осаждают центрифугированием (10 мин, бОООд), а супернатант выдерживают 72 ч при 4 С. Полученный раствор центрифугируют (20 мин, 6000g) для отделения образовавшегося осадка, затем доводят рН в нем-до 5,3 одно молярной уксусной кислотой и выдерживают ночь при . Осадок антигена К88 собирают центрифугированием и растворяют в забу|1эеренном физиологическом растворе.
йнстоту препаратов контролируют с помощью диск-электрофореза в поли- акриламидном геле с SDS. Концентрацию антигена К88 определяют по Лоу- ри. Калибровочную кривую строят относительно бычьего сьгоороточного а.льбумина..
Получение радиоактивномеченных анти-К88 иммуноглобулинов.
Специфическую анти-К88 сыворотку получают пятикратной иммунизацией кроликов путем внутреннего введения антигена К88, растворенного в забу- ференном физиологическом растворе, в количестве 0,5; 1-0; 2,0; 3,0; 4,0 мг с интервалом между инъекдая- ми антигена 7 дн.
Иммуноглобулины из сыворотки выделяют осаждением раствором сульфата аммония и последующей хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе в натрий- фосфатном буфере (0,0175 М рИ 6,3).
Иммуноглобулины метят радиоактив- ньм .Т по методу Остермана. В работе используют иммуноглобулины с удельной радиоактивностью 10 имп/мин х X мкг.
Проверка специфичности меченных. иммуноглобулинов.
мий-
ь
597727 4
Специфичность меченр{ых иммуноглобулинов проверяют по способности их связываться с клетками К88 - позитив- ного 1чтамма E.coli (штамм РМ1, выра- щенньп при ) и К88 - негативного штамма (штамм СбОО и штамм РМ1, выращенный при ).
В полиэтиленовые пробирки объемом
Q 1,5 МП вносят в натрий-фосфатном буфере (0,4 М, рП 6,0 буфер А) 1,5 миллиарда бактериальных клеток и 100 мкл меченных иммуноглобулинов. Объем смеси доводят буфером А до
IJ 600 мкл и смесь инкубируют 1 ч при комнатной температуре, после чего клетки осаждают центрифугированием (1 мин, 8000g). Осадок ресуспенди- руют с 1 мл буфера А, переносят в
20 новую пробирку и опять центрифугируют. Процедуру отмывания клеток от несвязавшейся радиоактивности повторяют дважды. Радиоактивность осадка определяют на гймма-счетчике.
25 Результаты определения спетщфич- ности меченных иммуноглобулинов представлены в табл. 1.
Как показывают полученные результаты, радиоактивность связавшаяся с клетками штаммов E.coli, не синте- зирунядими антеген К88 (С600 и. РМ1, выращенный при 18 С), находится на уровне фона. В то же время радиоактивность, регистрируемая на К88 клетках, в 15 раз превышает этот уро35 вень, что свидетельствует о специфичности меченных иммуноглобулинов .
Измерение продукции антигена К88 .штаммом E.coli КЭ-8, вырак(енным на
плотной питательной среде.
Клетки, штамма культивируют на питательном агаре при 37 С. Через 18-20 ч роста клетки смывают буфером А. Концентрацию клеток в суспензии определяют фотс 5 метрически.,Для определения количества антигена К88 на поверхности клеток в полиэтиленовые пробирки объемом 1,5 мл вносят по одному миллиарду исследуемых бактериальных клеток, ресуспендированных в буфере А. Затем в пробы добавляют антиген К88 в количестве от О до 400 мкг и буфер А до общего объема 500 мкл. Смесь перемешивают и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. Затем добавляют по 100 мкл меченных J анти-К188 иммуноглобулинов. Смесь инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Отмт.шпние клетом от несвязавшихся иммуноглобулинов и определение их рагсиоактивности проводят как описано при получении радиоактивно меченш.гх иммуноглобулинов. Колчество меченных антител в пробе (100 мкл) подбирают так, чтобы все молекул специфических иммуноглобулинов могли связаться с антигенами бактериальных клеток. Учитывая балан в пробе иммуноглобулина и антигена К88, получают следуки 1ие зависимости числа регистрируеиьгх импульсов радиоактивности от количества добавленного белка К88:
(1)
где 1,
Б + X
радиоактивность пробы в отсутствие в ней стандартного антигена К88 (конт- рольньпЧ образец) ; 1х радиоактивность при добавлении в пробу X мкг стандартного антигена К88; Б - количество антигена К88 в пробе,связанного с бактериальными клетками., мкг. Эту зависимость преобразуют к виду
- I -1-.(2,
X
Полученные для штамма E.coli КЭ-8 данш,1е, преобразованные по формуле (2), представлены графически на чертеже. По оси абцисс на это.й фигуре отложено количество добавляемого стандартного антигена К88, а по оси ординат - отношение радиоактивного счета контрольного образца к радиоактивному счету образца, в который добавлен антиген К88. Данные подтверждают справедливость прёдло20
инкубируют 1 ч и осаждают клетки це рифугированием на микрофуге (ускорение 8000). Надосадок отбрасывают а осадок суспендируют в 1 мл фосфатного буфера, переносят в новую пробирку и подсчитывают его радиоактивность. Затем клетки вновь осаж дают, переносят в следующую пробирк и подсчитывают радиоактивность. 25 В табл 2 приведены данные о ради активности бактериальных клеток пос ле первого и второго центрифугирован при разном времени центрифугирования
Ланные табл. 2 показывают, что 30 клетки- E.coli полностью осаждаются при центрифужном факторе (произведение ускорения на время центрифугирования) большем, чем 8000g мин. Пример 3. Отбор штаммов E.coli с повьппенной продукцией антигена К88 проводят следукищм образом. Выращивание бактериальных клеток на плотной питательной среде проводя как описано при измерении продукции 40 антигена К88.
В жидкой питательной среде (бульо не Хоттингера) клетки вьфащивают при 37 С 18-20 ч при интенсивной аэраженной модели: отношение радиоактив- ции (в 700 мкллилитровые колбы с ности образцов (IQ/I пропорцио- 5 отбойниками добавляют по 100 мл нально количеству добавляемого антиге- среды и инкубируют на качалке при на К88. Количество антигена К88 (мкг), 120 об/мин). Свежевыращенные клетки связанного с бактериальными клетками, осаждают центрифугированием (10 мин внесенными в инкубационную смесь, 6000g), ресуспендируют в буфере А равно котангенсу угла наклона прямой ЗО « Фотометрированием измеряют концентраидю клеток. Количество антигеБ
1«/1, (3)
на этом графике, или
X
I
Таким образом, 10 клеток штамма КЭ-8 проду1щруют 125 мкг белка К88. Усреднение результатов по шести независимым опытам дает 120 + 20 мкг на каждые 10 клеток.
на К88 на поверхности бактериальных клеток определяют, как описано в примере 1.
55 Результаты сравнительной оценки штаммов E.coli с разным количеством антигена К88 представлены в табл. 3. Результаты табл. 3 свидетельствуют что различные К88-позитивные пггаммы
1597727
линс
у
20
Пример 2. Выбор режима центрифугирования для осаждения и отмывки клеток от несвязавшейся радиоактивной метки.
Фосфатный буфер, концентрацию бактериальных клеток и меченную иммунную сыворотку используют те же, что в примере 1.
to К 100 мкл суспензии бактериальных, клеток штамма РМ1, в.1ращенного при 37°С и находящегося в центрифужных микропробирках объемом 1,5 мл, до- . бавляют 100 мкл меченной сыворотки 15 и 400 мкл буфера. Полученную смесь
инкубируют 1 ч и осаждают клетки цент- рифугированием на микрофуге (ускорение 8000). Надосадок отбрасывают, а осадок суспендируют в 1 мл фосфатного буфера, переносят в новую пробирку и подсчитывают его радиоактивность. Затем клетки вновь осаждают, переносят в следующую пробирку и подсчитывают радиоактивность. 25 В табл 2 приведены данные о радиоактивности бактериальных клеток после первого и второго центрифугирований при разном времени центрифугирования.
Ланные табл. 2 показывают, что 30 клетки- E.coli полностью осаждаются при центрифужном факторе (произведение ускорения на время центрифугирования) большем, чем 8000g мин. Пример 3. Отбор штаммов E.coli с повьппенной продукцией антигена К88 проводят следукищм образом. Выращивание бактериальных клеток на плотной питательной среде проводят как описано при измерении продукции 40 антигена К88.
В жидкой питательной среде (бульоне Хоттингера) клетки вьфащивают при 37 С 18-20 ч при интенсивной аэра ции (в 700 мкллилитровые колбы с 5 отбойниками добавляют по 100 мл - среды и инкубируют на качалке при , 120 об/мин). Свежевыращенные клетки осаждают центрифугированием (10 мин 6000g), ресуспендируют в буфере А ЗО « Фотометрированием измеряют концентраидю клеток. Количество антигена К88 на поверхности бактериальных клеток определяют, как описано в примере 1.
55 Результаты сравнительной оценки штаммов E.coli с разным количеством антигена К88 представлены в табл. 3. , Результаты табл. 3 свидетельствуют что различные К88-позитивные пггаммы
E.coli, вырапенные как на плотной, так и в жидкой питательных средах, различаются по количеству продуцируемого ими антигена К88 более чем в 10 раз. Это свидетельствует о целесообразности селекции производственных штаммов по уровню синтеза ими антигена К88.
Все указанные в табл. 3 штаммы являются продуцентами антигена К88, однако при изготовлении, например, вакцины с одинаковым протективным эффектом количество биомассы штамма Р99 необходимо в 14-20 раз меньше, чем штамма КС421.
. Таким образом, используя предло- женньй способ, можно определять количество антигена К88 на .поверхности клеток E.coli и осуществлять отбор эшерихий с повьшенной продукцией антигена К88. Такие штаммы необходимы для производства корпускулярных вакцин и лечебных сйтороток против колибактерноза, а также для выделения химически чистого антигена К88.
10
Формула изобретения
Способ отбора штаммов Escheri- chia coli-продуцентов антигена К88, включаюрщй приготовление суспензии клеток исследуемого штамма в физиологическом растворе, внесение иммунной сьшоротки, инкубатщю с последугогщм отбором штаммов по образованию иммунного комплекса, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности отбора за счет количественного определения уровня продуктр и антигена К88, суспензию клеток готовят в концентрации (1 - 1,5)-10 клеток/мл, в качестве иммунной сьгеоротки используют сыворотку , меченную , инкубацию проводят в присутствии стандартного раствора антигена К88, взятого в количестве 0,02 - 1 мг/мл, дополнительно осаждают полученный комплекс центрифугированием и определяют его радиоактивность, а отбор штаммов цроводят по количеству антигена на поверхности krieTOK,рассчитанному по изменению радиоактивности клеток при добавлении к ним раствора антигена К88.
20
25
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано для определения количества антигена К88 на поверхности бактериальных клеток E. COLI, а также для отбора штаммов эшерихий, характеризующихся повышенной продукцией указанного антигена. Целью изобретения является повышение эффективности отбора штаммов за счет количественного определения уровня продукции антигена К88. Для этого готовят суспензию клеток с концентрацией (1-1,5).109 /мл. Добавляют иммунную сыворотку, меченную 125 J. Инкубируют в присутствии стандартного раствора антигена К88, взятого в количестве 0,02-1 мг/мл, затем дополнительно осаждают комплекс центрифугированием. Определение радиоактивности комплекса, отбор штаммов проводят по количеству антигена на поверхности бактериальных клеток, рассчитанному по изменению радиоактивности клеток при добавлении к ним раствора антигена К88. 3 табл., 1 ил.
Итамм
т:
.Температура {радиоактивный счет осадка, имп/мин выращивания т;
Исходный счет образца, имп/мин
Счет осадка после первого центрифугирования имп/мин
Счет осадка после второго центрифугирования, имп/мин
Таблица 1
Таблица 2
124427
117542
8231
6300
5717
5007
реяультатм за исключением отмеченных; получен(.1 усреднением данных двух-шести опытов; нет данных. .
мкг
200 300
