Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L.-продуцент моноклональных антител к К99 адгезивному антигену ЕSснеRIснIа coLI Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к гибридной технологии и может быть использовано в ветеринарии для диагностики желудочно- кишечных заболеваний животных, вызываемых Escherichia coli.

Известен штамм ксеногибридомы 94А1, продуцирующей моноклональные антитела к К99 антигену E.coli. Для ее получения использовали мышиную миелому NSO (сублиния NS/1 Ад 4.1) и лимфоциты теленка, не секретирующие иммуноглобулины. При этом получены ксеногибридомы 53ВЗ и 53В4, не секретирующие иммуноглобулины. Затем ксеногибридома 53ВЗ сливалась с лимфоцитами теленка, секретирующие иммуноглобулины к К99 антигену Е.соН. В результате этих экспериментов получена ксеногибридома 94А1, продуцирующие моноклональные антитела к К99 антигену E.coli (D.V.Anderson et al., Bovine monoclonal antibodies to the F5 (K99) pilus antigen of E.coll produset by nurine/bovine Nybridomas.. Vet, Immunology and Immunopatology, 1987, v.15, p.223-237).

Кроме того, известен штамм гибридных клеток 2ВД4Е4, продуцирующий моноклональные антитела к К99 антигену E.coli штамма В44 и В41. Продуцируемые антитела относятся к классу G1, а титр антител, очищенных из асцитной жидкости, составил

VI VJ

О)

ю

СА 00

1:12000. Концентрация иммуноглобулинов составляла 45-50% белка асцитной жидкости. Гибридома получена при слиянии спле- ноцитов иммунизированных мышей и миеломной клетки линии P3-NS 1-Ag 4/1. Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой 2ВД4Е1, использовали для лечения телят, экспериментально зараженных К99 позитивными штаммами Е.соН. Результаты опыта показали, что заболеваемость в контрольной группе составила 82%, обезвоживание организма животных 82% и смертность 82%. тогда как в опытной группе животных заболеваемость составила 75%, обезвоживание организма 29% и смертность 29%. Таким образом, показана возможность использования моноклональных антител для лечения телят больных колибак- териозом. Данный штамм взят за прототип (Sadowski P.L. et al., Protection of Calvel Against Fatal Enteric Colibaclllosls by Oralil Administered Escherichla coli K99-speciflc monoclonal Antibody. - Infection and Immunity, 1983, v.42, № 2.

Таким образом, анализ литературы показывает, что в настоящее время известны два штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к К99 антигену. Указанные выше моноклональные антитела был использованы для лечебных целей.

В связи с тем, что антитела из асцитной жидкости, продуцируемые гибридомой 28Д4Е4 обладают сравнительно низкой активностью 1:12000 и продуктивностью 45- 50%, они менее пригодны для использования в диагностических целях.

Учитывая вышеизложенное, получена гибридома 3F6D, продуцирующая моноклональные антитела к К99 антигену Е. coii с достаточно высокой аффинностью. Это дает возможность использовать эти моноклональные антитела в диагностических целях.

Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующего моноклональные антитела к К99 адгезивному антигену E.coll.

Штамм гибридных клеток получен путем слияния миеломной клетки линии Х-63- Ад-8-653 со спленоцитами мышей, иммунизированных 4 раза с двухнедельным интервалом, очищенным дифференциальным ультрацентрифугированием К99 антигеном Е.соН штамма 09. Первую иммунизацию проводили 10 мкг К99 антигена с полным адьювантом Фрейнда, 2 и 3 иммунизацию такой же дозой антигена с неполным адьювантом Фрейнда. Последнюю иммунизацию проводили 10 мкг антигена в 0,15 М фосфатно-буферном растворе

и через 2 дня клетки селезенки использовали для гибридизации. Гибридизацию проводили добавлением к смеси 4х106 миеломных клеток и 20x10 спленоцитов 1 мл раствора,

содержащего 45% ПЭГ-4000, 10% диметил- сульфоксида и 45% среды RPM1-1640. Затем оставляли для инкубации на 10 мин. После этого клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин.

Осадок клеток ресуспендировали в среде RPM1-1640 с добавлением 10% по объему эмбриональной сыворотки теленка и высевали в 96-луночные планшеты по 100 мкл на лунку. На следующий день в эти лунки вносили среду с гипоксантином, аминоптери- ном и тимидином (ГАТ). Через каждые 3-4 дня проводили подкармливание клеток. Через 10-14 дней после слияния в лунках, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм,

отбирали культуральную среду для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводили методом иммуно- ферментного анализа с использованием очищенного К99 антигена методом дифференциального ультрацентрифугирования и кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши, меченных пероксидазой. В течение 21 дня после слияния клетки находились в среде ГАТ. Затем постепенно переводились

на среду ГТ и полную среду RPM1-1640. Клоны клеток, продуцирующие моноклональные антитела, дважды клонированы методом лимитирующего разведения. После второго клонирования 100% субклонов

продуцировали антитела к К99 адгезивному антигену Escherichla coll. Штамм гибридных клеток продуцирует антитела в культуральную среду и в асцитную жидкость.

Штамм гибридных клеток 3F6D хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 519 Д. Штамм характеризуется следующими свойствами.

Морфологические свойства. Гибридные клетки представляют собой слабоприкрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка.

Культуральные свойства. Гибридные клетки выращивают в среде RPM1-1640, содержащей инактивированную нагреванием сыворотку эмбрионал коров (10-20%), Lглютамина200мМ(20мл/л), HEPES-(3,375 г/л), пируват натрия; 2-меркаптоэта- нол(5x1 ОМ), пенициллин(100ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), бикарбонат натрия 37 г/л), Клетки культивируют при 37°С в атмос фере 5% . Характер роста - стационармая суспензия. Посевная концентрация клеток 2x10 клеток в 1 мл. Частота пассирования клеток через 2-3 сут. При внутрибрюшинном введении сингенным мышам штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме на 14-18 день. Доза клеток при прививке 2х105 клеток. За 14 дней до введения гибридомы мышам инъецировали 2,6,10,14-тетраметилпентадекан в дозе 0,5 мл на голову. Штамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклональные антитела в течение 4 пассажей на сингенных мышах (время наблюдения).

Продуктивность штамма. На 8 день культивирования гибридомы концентрация антител достигает 5 мкг/мл в культуральной среде. В очищенной асцитной жидкости концентрация иммуноглобулинов составляет 8 мг/мл, а их титр 1:200000.

Характеристика полезного продукта. Моноклональные антитела относятся к иммуноглобулинам подкласса G1. Моноклональные антитела специфически взаимодействуют с К99 антигеном E.coli с молекулярной массой 18,5 КДа. Специфичность моноклональных антител определяли методом иммуноблотинга.

Контаминация. Контаминантов в клетках, включая бактерии, грибы, дрожжи и ми- коплазмы, не обнаружено.

Криоконсервация. К осадку гибридных клеток добавляли эмбриональную сыворотку коров, а затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10%, Суспензию разливали в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 2x10 клеток в объеме 1 мл. Ампулы помещали в коробку из пенопласта и оставляли на сутки при -70°С, а затем переносили в жидкий азот,

Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещали в водяную баню на 37°С. Как только растают последние кусочки льда, суспензию клеток перено- сили стерильно в пробирку, содержащую 10 мл холодной безсывороточной среды, отмывали один раз и засевали в ячейки 24-луноч- ной планшеты с питающим слоем перетониальных макрофагов. Число жизне- способных клеток после размораживания не менее 60%.

Штамм 3F6D используют следующим образом.

П р и м е р 1. Гибридные клетки поме- щают в пластиковые матрасы площадью 25 см по 5x10 клеток в 5 мл питательной среды и инкубируют 3 дня при 37°С в атмосфере 5% С02. Культуральную среду собирают и центрифугируют 10 мин при 800д с целью

отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащую антитела. При культивиро- вании гибридомы на мышах иммуноглобулины из асцитной жидкости получали методом высаливания сульфатом аммония до 50% насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем 0,15 М фосфатно-буферного раствора (ФБР). рН7,2. Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4°С. Иммуноглобулины отделяют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин, при 4°С. Осадок антител ре- суспендируют в минимальном объеме ФБР. П р и м е р 2. На нитроцеллюлозную мембрану, предварительно нарезанную на

8полос, наносят по 1 мкл раститрованного К99 антигена. Раститровку проводят с 10 мкг/мл до 1 нг/мл. Полоски мембраны инкубируют 1 ч при 37°С в 1,5% BSA для забивки свободных поверхностей мембраны. После инкубирования полоски отмывают 3 раза по 10 мин в 0,15 М ФБР с 0,1% Твином-20 (ФБР-Тв). Отмытые полоски инкубируют 1 ч при 37°С в 8 разведениях моноклональных антител с 1:1000 до 1:12000. После инкубирования полоски мембраны отмывают, как описано выше, и инкубируют в растворе с антителами кролика против иммуноглобулинов мышей, меченных пероксидазой хрена. Через 1 ч инкубирования при 37°С повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных компонентов реакции. Реакцию проявляли добавлением субстрата. Субстрат готовится растворением 8 мг 4- хлорнафтола в 1 мл этанола и добавлением

9мл ФБР и 5 мкл 30%-ного раствора перекиси водорода. Рабочее разведение моноклональных антител составляет 1:1000, т.е. при таком разведении антитела выявляют 1 нг/мл К99 антигена.

П р и м е р 3. Для определения молекулярной массы белка, ,к которому получены моноклональные антитела, проводят электрофорез и перенос белка на нитроцеллюлозную мембрану с последующим иммунохимическим проявлением (иммуноб- лотинг). Электрофорез белка проводят в 11% полиакриламидном геле в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия. Перенос белка на нитроцеллюлозную мембрану проводят методом полусухого электроблотинга в аппарате фирмы Hoefer Scientific Instruments при силе тока 0,8 А на 1 см2 геля, в течение 2 ч. Окрашенный гель был исследован на денситометре с программным обеспечением для компьютера фирмы Hoefer Scientific.

7 17739388

Нитроцеллюлозную мембрану исполь-Результат. Иммуноблотинг показал, что

зуют для иммунохимического проявлениямоноклональные антитела специфически

антителами. Для этого нитроцеллюлознуюсвязываются с белком молекулярной масмембрану инкубируют в 1,5% BSA в тече-сой 18.5 КДа. По литературным данным К99

ние ночи при комнатной температуре, затем5 антиген Eschertchla coll имеет молекуляринкубируют в растворе очищенного прела-ную массу 18,5 КДа. Полученные моноклората антител в разведении 1:500 в течениенальные антитела будут использованы в

1 ч. После этого носитель инкубируют в те-ИФА для диагностики колибактериоза.

чение 1 ч при 37°С с антителами кроликаФормула изобретения

против иммуноглобулинов мыши, коньюги-10 Штамм гибридных культивируемых клерованных с пероксидазой хрена. Реакциюток животных Mus Musculus L- ВСКК(П) Ms

проявляют субстратом, содержащим 4-519 D-продуцентмоноклональных антител к

хлор-нафтол, перекись водорода, ФБР.К99 адгезивному антигену Escherlchla coll.

Использование: биотехнология, иммунология. Сущность изобретения; получают штамм путем гибридизации миеломных клеток линии Х-63-Ад-8.653 со спленоцитами мышей, иммунизированных К99. Штамм обозначен 3F6D и хранится под номером ВСКК(П) № 519 D. Штамм продуцирует моноклональные антитела, специфически взаимодействующие с К99 антигеном E.coli с мол. массой 18.5 KDa. Титр антител в асцит- ной жидкости достигает 1:200000. (Л с