(Бензофуран-2-ил)-имидазолы, обладающие противогрибковой и антибактериальной активностью Советский патент 1990 года по МПК C07D405/06 A61K31/343 A61K31/4178 A61P31/10 

05

оо

Изобретение касается гетероциклических веществ, в частности получения (бензофуран-2-ил)-имидазолов общей формулы @ и при этом а)R₁-H

R₂ - 2-хлор, б) R₁ - 5-хлор, R₂ - H, в) R₁ - 5 - BR

R₂ - H, г) R₁ - 5 - CL

R₂ - 2 - CL

д) R₁ - 5,7-дихлор

R₂-H, обладающих противогрибковой и антибактериальной активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых с широким спектром активностей веществ указанного класса. Синтез ведут реакцией имидазола с соответствующим замещенным бензофурана в среде диоксана при температуре дефлегмации с последующим переводом в хлоргидрат полученного основания. Новые соединения малотоксичны (LD₅₀=750-900 мг/кг) и проявляют сравнимое с эконазолом и клотримазолом антибактериальное действие и в широком диапазоне активность против грибковых, патогенных микроорганизмов, например дрожжей, дерматофитов и мономорфных гифомицетов. 10 табл.

Изобретение относится к новым соединениям - (бензофуран-2-ил)-инида- золам, обладающим противогрибковой и антибактериальной активностью, что может быть использовано в медицине.

Цель изобретения - новые производные имидазола, обладающие как антибактериальной, так и противогрибковой активностью.

Изобретение иллюстрируется следу- ЮВ1ИМИ примерам.

Пример 1с, Хлоргидрат -(5-. -бромбензофуран-2-ил)фенилметил J- -1Н-имида3ола.

К 11,9 г имидазола в 250 мл диоксана при температуре дефлегмации и при сильном перемешивании добавляют по каплям 28,1 г (5-бромбензофуран- -2-ил)фенилметилхлорида в 200 мл диоксана при поддержании смеси при температуре дефлегмации еще в течение 5ч, затем смесь охлаждают, фильтру ы

ют и маточные воды упаривают досуха. Остаток снова берут в этиловый эфир, промывают- сначала 2%-ным раствором гидроокиси натрия, а затем водой; из эфирных растворов соединение экстрагируют с помощью 5%-ного раствора соляной кислоты, а затем подщелачивают 5%-ной гидроокисью натрия, получают масло, которое экстрагируют этиловым эфиром. Эфирньм экстракт промьшают, сушат и доводят досуха, получают твердое вещество, которое кристаллизуют из изопропанола. То пл. 123-12А С„

Продукт растворяется в этилацета- те, затем газообразный НС1 выделяет- с;я, дава51 осадок, т„ пл 173-174 С

(ацетон)«

П р и м е р 2о Хлоргидрат i-L(5- -хлорбензофуран-2-ил)-(о-хлорфенил)-- 4метил }-1И-имидазола. К 0,2 моль имидазола в 200 мл диоксана медленно добавляют 0,07 моль I5-хлорбензофуран-2-ил)-(о-хлорфе- йил)метилхлорида в 1 О мл диоксана при перемешивании при температуре кипения; члрез 5 ч смесь охлаждают, фильтруют, и маточные жидкости сушат :р условиях вакуумирования. Полученное таким образом масло, экстрагируют этиловым эфиром, промывают 2%-ным раствором гидроокиси натрия, водой, а затем экстрагируют 5%-ным растворо НС1. Подщелачиванием 5%-ной гидроокисью натрия получают осадок, который экстрагируют простым эфиром, и раствор насьпцается газообразным НС1, осадок, полученный таким образом, кристаллизуют из ацетона, т. пл. 1/8180°С.

С помощью растворения гид-рохло- рида в воде и нодщелачивания получают масло, которое экстрагируют этилвым эфиром, раствор обезвоживают, доводят досуха, и основание кристсял лизуется из гексана, т. пло 70-80 С

(разлож.).

Пример 3с Хлоргидрат 1- Г(бензофуран-2-ил)фенилметил -1Н-имидазолао

К 0,08 моль имидазола в 70 мл ацетонитрила при добавляют

0,22 моль тионилхлорида с последующим вьщерживанием в течение 1 ч, а затем добавляют 0,02 моль (бензофу- .ран-2-ил)фенилметанола в 20 мл ацетнитрила. Реакционную смесь выдерживают в течение 24 ч при температуре

0

5

20

25

30

35

40

45

50

55

окружающей среды, а затем концентрируют досуха. Остаток экстрагируют в этиловый эфир, прбмьгоают сначала раствором гидрата натрия, а затем водой; хлоргидрат получают из эфирных растворов с использованием 5%-ной соляной кислоты, затем получают масло с Подщелачиванием 5%-ной гидроокисью натрия, которое экстрагируют этиловым эфиром. Эфирный экстракт промьшают, обезвоживают и насьщают газообразным НС1, полученный таким образом осадок кристаллизуют из изопропанола, т. пл. 205- 207°С (разло).

Пример 4. (5-Бромбензофу- ран-2-ил)-(п-хлорфенил)метилхлорид.

К 36,2 г (5-бромбензофуран-2-ил)- -(п-хлорфенил)метанола, растворенного в 50 мл метиленхлорида, добавляют по каплям при перемешивании 8,6 мл тионилхлорида в 25 мл циклогексана. После выдерживания в течение 4 ч при раствор доводят досуха в условиях вакуума. Остаток кристаллизуют из петролейного эфира, т пЛо 8385 С о

Пример 5. (5,7-Дихлорбензо- фуран-2-ил)-(п-хлорфенил)метилхлорид..

к о, 35 моль тионилхлорида в 300мл циклогексана добавляют порциями 0,31 моль (5,7-дихлорбензофуран-2- -ил)-(п-хлорфенил)карбинола с последующим 3-часовым перемещиванием при температуре окружающей среды, затем раствор концентрируют, фильтруют и кристаллизуют из циклогексана, т.пло 72-74°С.

Пример 6, (5-Хлор Зензофу- ран-2-ил)(2 -хлорфенил).

1 г (65 ммоль)5-хлорсалицилаль- дегида прибавляют к раствору, содер жащему 2,6 г (65 ммоль) NaOH в 75 мл безводного этанола. Вьщерживают полученный раствор при температуре примерно с его перемещиванием, медленно прибавляют к нему 9,4 г (65 ммоль) 2-хлор-У-бромацетофенона. Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в теч.ение 8 ч, охлаждают и образовавшийся осадок собирают фильтрованием. Твердое вещество про- мьгоают этанолом, водой и сушат в сушильном шкафу.. Выход составляет 62%, т, пл. 75-77 с.

(5-Хлорбензофураи-2-ил)-(2 -хлор- фенил) мета кол „

51600630

Полученный ранее кетой растворяют в 50 мл диоксана с последующим его восстановлением 1,5 г (АО ммоль) NaBHi, при температуре ниже . Полученный раствор пере-мештшают в течение 6 ч, упаривают до объема 1/3 и разводят водой о Отделенное масло экстрагируют этиловым эфиром, про- мьшают водой и сушат над безводным- сульфатом магния о После упаривания остаток перекристаллизовьгоают из гексана с выходом 89% продукта, т. пло 90-91 С.

(5-Хлорбензофуран-2-ил)-(2 -хлор- фенил)метилхлорид.

Раствор, содержащий 10,4 г (Збммоль) (5-хлорбензофуран-2-ил)- (2 -хлорфе- нил)метанола в 80 мл хлороформа обрабатывают по каплям при комнатной температуре 3 мл (40 ммоль) SOCli. Затем полученный раствор нагревают до 40 С в течение 1 ч, и после отгонки избытка SOCl/г п вакууме вместе с растворителем получают масло, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

1 - 1.(5-Хлорбензофуран-2-ил) -(2- -хлорфенил)метил ,имидазол„

В 100 мл кипяьчего диоксана растворяют 7,5 г (110 моль) имидазола, а затем медленно прибавляют 36 ммоль (5-хлорбензофуран-2-ил)-(2 -хлорфе- нил)метилхлорида, растворенного в 20 мл диоксана. После кипячения реакционной смеси в течение 5 ч с обратным холодильником раствор охлаждают, фильтруют и упаривают в вакууме. Полученное масло поглощают этиловым эфиром, промьшают водой и экстрагируют 2%-ным раствором НС1, После подще- лачивания раствора 5%-ным NaOH получают осадок, который экстрагируют опять этиловым эфиром с последу оп1им насьшдением экстракта газообразным НС1. Полученный осадок отфильтровывают, сушат над и выкристаллизовывают из ацетона (т. пл 178- 180 С). ТСХ: хлороформ/этилацетат, 4/1, Rf 0,45. Полученный хлоргидрат растворяют в воде. Полученное свободное основание при взаимодействии

10

f5

20

25

30

35

40

45

к

з м т

т з ко

д

50

ис ем ис бу

ря це ны ре 55 ко ср ям пи

с NaHCOj экстрагируют простьпч эфиром , обезвоживают и упаривают. Осадок выкристаллизовывают из гексана, выход 45%, т. пл„ 78-80°(;. Приведен элементный анализ для C,H,N.

Целевые соединения представлены в табл. 1.

0

5

0

5

0

5

0

5

Точки плавления указанных соединений определены в открытых: капиллярах, их значения неоткорректированы. ИК-спектры записаны на. спектрофотометре Parkin Elmer FT 1710 в фазе Nujol. Н-ЯМР спектры записаны на приборе Hitachi-Parkin Elmer R24, используя триметилсилан в качестве В1гутреннего стандарта. Элементный анализ проводили аналитическ1-1М отделением компании Manarini Farmac eu- tici, который находится в пределах to,4% от расчетных значений.

Результаты.

Данные биологических испытаний

Испытания in vitro.

Исследованы-in vitro 10 производных бензофураноБьк имидазолов формулы (I) для определения их противогрибковой активности против 70 штаммов грибков путем сравнительного анализа с 3 известными имидазолами и действие гризеофульвина в отношении только дерматофитов.

Очень высокая ингибиторная активность против дерматофитов была продемонстрирована 5 из указанных соединений формулы (I).

Другие гифомицеты и дрожжи продемонстрировали более заметную ва- риащпо в их восприимчивости. Однако отмечена прекрасная восприимчивость некоторых изолятов из Candida и других дрожжей.

Известно, что производные имидазола обладают широким спектром анти- микотического действия как in vitro, так in vivo.

Для сравнения испытание подвергли также эконазол, клотримазол, бифона- зол и гризеофульвин в отношении только дермафитов.

Эксперименты проводили in vitro. Дрожжи испытьшали по методу разведения в агаре, в то время как для

50

испытания на чувствительность испытуемых соединений к грибковой плесени использовали методику разведения в бульоне..

Все испытуемые соединения растворяли в ДМСО при начальной их концентрации 2560 мкг/мл. Метод серийных развелент1й использовали для определения минимальной ингибиторной 55 кониентрации (МИК), при которой по сравнению с контрольными соединениями не наблюдали никакого макроскопического фунгицидного развития.

71

Испытанию подвергли н сумме 70 патогенных и оппоатунистических штаммов, в том числе АО видов дрожжей,, 20 дерматофитов и 10 гифомицетов Фунгицидные штаммы представляли собой культуры, выделенные на послед-- ней стадии заболевания или полученные из лабораторной коллекции куль.- тур.

Дрожжевые бластоконидии получены из 18-часовой культуры при 37°С на декстрозном агаре Сабуро с последующим их суспендированием в стерильном физиологическом растворе и раз- ieдeниeм до титра I л кл,/мл„ Первый тест проводили на модифицированном агаре Сабуро (2% неопептон с 1% ггао- козой) при рН 6,5„ Подсчет полученных данных осуществляли после инкубирования, в течение 18 ч при , Для второго теста использовали модифицированный агар Сабуро при рН 7. Другие параметры не меняли.

При использовании методики разведения в агаре приготавливали серийные разведения каждого из испытуемых BeniecTB в дозе 128 - 0,03 мкг/мл в 10 мл стерильного физиологического раствора. Затем по 2 мл из каждого разведения брали и смешивали с 18 мл стерильного модифицированного агара Сабуро, находящегося в расплавленном состоянии, а затем полученную Смесь выливали в чащки Петри К каждой серии с различными ко1щентрациями исытуемого препарата прибавляли чашку с такой же средой, но без испытуеого вещества, в качестве контрольной. Каждую серию чашек каждого испытуемого вещества инокулировали ноготочечным инокулятором.

Инокулят дерматофитов соскабливали, соблюдая асептику, с 7-дневной культуры на декстррзный агар Сабуро, затем суспендировали в стерильном физиологическом растворе с разведением до получения конечного ино- кулята с титром 1«10 кл/мЛо Тест проводили в бульоне с микофлорой при рН 7,0. Через 7-10 дней после инкубации при 30°С считьшали полученные данные

Другие гифомицеты выращивали на агаре Сабуро в течение 72 ч, а затем, собирали в стерильный физиологический раствор. Полученьгую суспензию доводили до титра примерно 1х10 кл/мл

006308

Тест проводили в бульоне с микофло- рой (рН 7,0).

При использовании метода разведения в бульоне приготавливали серий- 5 ные разведения испытуемых веществ

путем двукратного разбавления. Конечная концентрация колебалась от 128 до 0,03 мкг/мл о. Указанные серии, вместе с-контрольной группой, не содержащей испытуемых лекарств, инкубировали при З7 с в течение 3-7 ч в со- особенностями разви10

fS

20

25

30

35

0

5

0

5

ответствии с тия штаммов.

Результаты.

Дрожжи-.

Данные, сведенные в табл. 2, получены из первой серии экспериментов на Candida albleans при рН 6,5 Другие виды дрожжей также показьшали с лабую восприимчивость ко всем 13 веществам, только кроме производных 7, 8 и 9, которые проявляли хорошую активность против Crytococus neoformans. Неудовлетворительные ре- зультаты заставили модифицировать условия испытания путем повышения рН до 7.

Полученные данные второй серии экспериментов на дроюках подробно представлены в табл„ 3 и 4 относительно С. albicans и других видов дрожжей соответственно. В табл. 5 приведены данные интервала минимальной ингибиторной концентрации (МИК), 50% МИК и 90% МИК на 26 штаммов С. albicans.

Некоторые из указанных штаммов обнарз ивают высокую устойчивость ко всем из испытуемых препаратов, в том числе к тем из контрольньпс, которую проявляет штамм№ 2 С. albi cans. Другие изоляты демонстрировали разброс относительно высокой чувствительности, которую проявляли штаммы 3,В5,19/11,23/12,26/13,29/15, 30/16, 31/17,34/20,35/21.38/24, не- которые из которых бьши более восприимчивы к бензофурановому имидазолу № 9, чем хотя бы к одному из известных имидазолов (штаммы № 3,В5 19/11, 35/21).

Другие виды дрожжей показьюали значительные колебания их восприимчивости к испытуемым веществам, В сущности ингибиторная способность клотримазола, эконазола и бифанозола, как оказьшается, была вьше, чем у бензофурановых имидазолов. Тем HP

менее очень значительна активность соединений №№ 2,8 и 9 на штамм 24 С. pseudotropicalis. Соединение № 9 проявляло самую высокую активность против видов Torulopsis glabrata и Phodotarula.

Антимикотическая активность всех испытуемых препаратов увеличивалась при повышении рН с 6,5 до 7,0, Что касается Сг. neoformans, наоборот, самые высокие результаты получены при более низком значении рН 6,5. При таких условиях Сг. neoformans ингибировали 0,5 мкг/мл соединения 9 и 1 мкг/мл соединений 7 и 8, Полу ченные данные демонстрируют аналогич нзто или более высокую активность по сравнению с результатами, полученными при использовании эконазола., кло- тримазола и бифоназола (табл. 6).

Дерматофиты.

Результаты этих экспериментов преставлены в табл. 7 и 8„ Как видно из данных табл. 7, самьм активным препаратом явл яется эконазол, причем все штаммы ингибировали указанным препаратом в концентрации 0,25 мкг/мл Кензофурансвые имидазолы, как установлено, были высокоактивными против

дерматофитов, даже если можно бьшо наблюдать больший разброс значений МИК.

Для каждого соединения были рассчитаны предельные значения МИК на деформатофиты, которые приведены в табл. 8о

Почти все из испытуемых микроорганизмов продемонстрировали высокую восприимчивость к соединениям 2,7,8, 10 и 9.

Активность указанных веществ была аналогичной клотримазолу и вьше по сравнению с бифоназолом и гризео- фульвином. Среди испытуемых дерматофитов наиболее чувствительными видами оказались Erichophyton rubnim, Т. mentagrophytes, Т. verrucosum и Epidermophyton floccosum. Род Micro- sporum, как оказалось, проявлял мене сходную чувствительность как к клотримазолу, бифоназолу и гризеофуль- вину, так и вьппеуказанным бензофура- новым имидазолам. Две вьделенные культуры из Microsporura canis были более чувствительны к соединениям 2,7,8 и 10 по сравнению с клотрима- золом, бифоназолом, гризеофульвином и соединением 9. Один из изолятов

.

10

15

.

0063010

М, gypseum, который проявлял высокую резистентность к бифоназолу (МРТК-128 мкг/мл), ингибировали 5 бен- зофурановыми имидазолами (2,7,8,9 и 10) при низких концентрациях, Активность соединения 9 против двух штаммов М. audouinii была одинаковой, как и у эконазола, клотримазола или гризеофульвина, и выше по сравнению с друпми бензофурановыми имидазолами и бифоназолом.

Другие виды грибков.

К указанным видам относились са- пробионтные или условнопатогенные штаммы рода Aspergillus, Penicillium, J Geotrichmn, Trichodermaи Aureobasi- dium. Чувствительность их к бензофу- раковым имидазолам приведена в табл. 9. При сравнении с известньми противогрибковыми веществами, включенными в данное исследование, отмечается прекрасная активность соединений 7,8,9 и 10 против Penicillium и, главным образом, против Aspergillus/ Geotrichum candidbm и Trichoderma viride - самые высокочувствительные виды указанной группы. Однако, один штамм из G. candidum обнаружи- вает умеренную восприимчивость к соединению 9.

Обсуждение.

Анализ полученных результатов in vitro, приведенных в данном иссле20

25

30

5

0

5

0

5

довании, показьшает, что бензофурано- вые имидазолы проявляют широкий диапазон действия и обладают хорошей ингибиторной способностью против множества грибковых патогенных микроорганизмов, в том числе дрожжей, дерматофитов и других мономорфных гифо- мицетов.

Аналогичное многим другим производным имидазола, на их антимикоти- ческое действие, как установлено, оказывают значительное влияние условия испытания, особенно рН культура ль ной среды. Однако, в основном новые предлагаемые препараты демонстрируют широкий диапазон их деист- -ВИЯ на семейства рода Candida; виды albicans, как установлено, более чувствительны по сравнению с видами, не относящимися к albicans. При испытании соединений против патогенных дрожжей, например как Tonilopsis glabrata и Phodotorula, соединение 9 проявляло большую активность по сравнению с клртримазолом, эконазо11

лом и бифоназолом. Кроме того, это соединение демонстрировало самую высокую ингибиторную активность относительно Cryptococcus в первом тесте при рН 6,5.

Выявлено, что бензофурановые ими- дазолы проявляют самую высокую ингибиторную активность против дермато- фитов, Их активность против дермато- фитов в большинстве случаев была одинаковой или вьш1е, чем у эконазола и клотримазола, и главным образом, превосходила активность, чем у грй- зеофульвина.

Соединения 2,7,4,0,8и 9 проявля ли сильное действие на наиболее часто встречающиеся патогенные микроорганизмы этой группы гр. mentagrophy- tes, Т. rubrum, М. canis, Е, flocco- sums даже « случае, когда М, canis, как устаноШ1ено, проявляет низкую чувствительность к соединению 9.

Восприимчивость мономорфных гифо- мицетов, кроме дерматофитов, к бен- зофурановым имидазолам относительно низка.

Отмечают умеренную чувствительность к указанным имидазолам видов Aspergillus и Penicillium.

Поскольку активность in vitro любого противогрибкового препарата не может точно отразить его потенциальное терапевтическое действие, то большинство соединений формулы (I) следует подбирать для последующих исследований, для оценки эффективности их биологических свойств о

В табЛо 10 перечисляется противо- бактериальная активность соединений формулы (I)..

Соединение формулы (I) DLjj OS в мыши составила 500-1000 мг/кг (живой массы, в мыши ддтя бифоназола и клотримазола составляют 2629 мг/кг,

Противобактериальная активность,.

Эксперименты были проведены in vitro (в колбе, в пробирке) путем определения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) с использованием метода разбавления в агаре и бульоне

Дпя этого изучения были иcпoJ: ьзo- ваны 377 бактериальных штаммов клинического происхождения, из которых 256 бьши грамположительньгх и 121 грамотрицательных.

Все испытанные вещества были раст ворены в ДМСО при начальной концентрации 2560 мкг/мл. Для осуществления

опытов были использованы следующие разбавления, полученные удваиванием, мкг/мл: 128,6А; 32; 16,8; А; 2; 1,0; 0,5; 0,25; 0,12; 0,06; 0,03. 5 Культурные среды.

Были использованы следующие культурные среды: агар Мюллера-Хинтона для энтеробактерий, Pseudomonas, staphylococcus и Bacillus cereus; агар Rogoca для Lactobacillus; Тодда- Хевитта для д-гемолитического стрептококка и энтерококка; жидкий тис-, гликоллят для Trichomonas.

Прививочньй материал.

10

15

20

25

30

35

18-Часовые культуры при.37 С бьши разбавлены в стерильном физиологическом растворе до достижения концентрации порядка 10 кло/мл.

Результаты.

Результаты опытов, выраженные в МИК-интервале (мкг/мл), приведены в табл 10, сравнение было проведено с эконазолом, клотримазолом и бифоназолом.

Вьшоды.

Из изучения полученных результатов видно, что Противобактериальная активность производных имидазола формулы (I) в целом является сравнимой с противобактериальной активностью зконазола и клотримазола, учитьшая полное отсутствие активности бифоназола.

Результаты биологических испытаний показывают, что наиболее активными являются соединения 2,7,8,9 и 10, их LD« (через рот на мышах) составляет

Величина W gy 900 700 800 800 . 750

Соединения 2 7 8 9

10

Соединения являются перспективными для их использования в медицине, Формулаизобретения

(Бензофуран-2-ил)-имидазолы обшей формулыRi- П-снХ

,. Vv™

5

где RJ . R,

Ни R j- 2-С1; 5-С1 и R 2 - Н; 5-Вг и R. - Н; 5-С1 и R - 2-С1

или

- 5,7-0. и R Н,

обладающие противогрибковой и антибактериальной активностью.

15

60063С16

Продолжение табл. 2

ИнгиСиторная активность 13 бенэоураноеых имидазолов

Таблице 3

Ингибиторная активность 10 бензофурановых имидазолов против С. albicans МИК, мг/мл

Ингибиторная активность 10 бензофурановых имидазолов против Cryptococcus neoformans при 2 значениях рН

Таблиц.а 5

Таблицаб

160063024

Таблица 8

Граничные значения активности 10 бензофурановых имидазолов против дерматофитов

Противогрибковые препараты

0.25,2

Оо 25

О о 25 о 128 . Оо25«16

0.25о16 0.25.16

Ос25о4

0.25.4

0.25о16

0.25о8 Оо25„2

0.25.2 0.25о8

0,25«4

МИК, мг/мл