Способ разделения субчастиц 70 S рибосом Советский патент 1990 года по МПК C07K1/16 

Изобретение относится к молекулярной биологии и препаративной биохимии, а именно к способам получения нативных 30 и 50S рибосомных субчастиц.

Цель изобретения - сохранение нативности рибосомных субчастиц и повышение их выхода.

Подобраны условия разделения субчастиц 70s рибосом на гидрофобном носителе бутил-Тоеперл 650S, которые обеспечивают сохранность их нативности, поскольку эффект разделения на .бутил-Тоеперл .650S основан на разли- чиях гидрофобных свойств, присущих нативным рибосомальным субчастицам. ,

Сущность изобретения заключается в 2-этапной хроматографии диссоциированных 70S рибосом на колонке с . гидрофобным носителем бутил-Тое- перл 650S.. На первом этапе используемые буферные системы обеспечивают связывание с носителем исключительно 30S субчастиц, в то время как 50S субчастицы сходят с колонки в ходе промывки. Вслед за этим проводится элюция 30s субчастиц соответствующим буферным раствором. Присутствие цит- рата Na и ионов Mg в используемых буферных системах посадки, промывки и элюции препятствует ассоциации субчастиц и способствует сохранению

их нативности. Второй этап предусматривает концентрацию и очистку фракции 50S субчастиц при повторной хроматографии на той же колонке, но в других ионных условиях, которые определяют адсорбцию 50S субчастиц на носителе. Способ позволяет получить выход продукта - препаратов нативных 30 и 50S субчастиц 70S рибосом.

Пример, 70S рибосомы .(в количестве 150-200 мг), находящиеся в буфере, содержащем 50 мМ .трис-НС1 (рН 8,0), 500 мМ цитрата натрия, . 300 мМ MgClj, 1 мМ ДТТ, наносят на колонку (0 2,5 см, V 60 мл)с . . гидрофобной смолой бутил-Тоеперл 650s уравновешенной этим же буфером. Далее колонку промывают стартовым буфером |ДО тех пор, пока значение оптической плотности регистрируемого материала не выходило на плато (близкое к базовой линии). В результате этого рибо- |сомньге 308 субчастицы, отличающиеся по гидрофобным свойствам от 30S субчастиц, в основном адсорбировались на колонке, а последние оказывались в промывных водах. Далее ЗОВ ;субчастицы элюируют с колонки разбив- ;ленным в 5 раз стартовым буфером, А к промывным водам, содержащим в основном 508 субчастицы (около 90%),- добавляют сухой (КН)2 804ДО концен- трации 0,5 М, при этом увеличив концентрацию MgCl2 до 0,5 М, и наносят на ту же колонку, уравновешенную буфером, содержащим 50 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 1 М (ЫН4)г804, 50 мМ MgCl,;, 150 мМ , 1 мМ ДТТ, Элюцию 50S субчастиц проводят обратным градиентом сульфата аммония (0,8-0,25 М) на том же буфере,.Фракции основного пика оптической плотности, соответствующие 508 субчастицам, собирались

Для успешного осуществления предлагаемого способа необходимо строго соблюдать следующие параметры: концентрации солей цитрата натрия, хлористого магния и сульфата аммония допустимый интервал температуры 4- 6°С,

Таким образом, предлагаемый спосо обеспечивает сохранение нативности конечных продуктов - 30 и 50s рибосомных субчастиц и увеличение их выхода до 80%, Использование для реализации данного метода стандартного хроматографического оборудования существенно удешевляет и облегчает получение рибосомных субчастиц в натив- ном состоянии по срабнению с известным способом их получения - центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы. Кроме того, использование предлагаемого способа позволяет снять ограничения и в количестве разделяемого материала, что достигается увеличением объема колонки, например 300 мм новителя достаточно для хроматографии 1 г 70S рибосом. Все перечисленное позволяет охарактеризиро- вать предлагаемый способ как простой экономичный и высокоэффективный.

Предлагаемый способ целесообразно использовать в молекулярно-биологи- ческих исследованиях и при решении задач прикладной биохимии для крупномасштабного выделения рибосомных,субчастиц, Предлагемый способ может также найти применение и в области биотехнологии для биосинтеза биологических препаратов белко вой природы различного назначения.

Формула изобретения

Способ разделения субчастиц 70S рибосом, включающий хроматографию на гидрофобном носителе, отличающийся тем, что, с целью сохране ния нативности субчастиц и повышения их выхода, в качестве гидрофобного носителя используют бутил-Тоеперл 650 а хроматографическое разделение .осуществляют в 2 этапа - сначала через колонку пропускают рибосомы в буферном растворе, содержащем цитрат Na в концентрации 500 мМоль иМеС в концентрации 300 мМоль и элюируют адсорбированные 30S- субчастицы тем же буферным раствором,разбавленным в 5 раз, прошедший через колонку раствор подвергают повторному хрома- тографированию в присутствии 150мМоль MgCl и 1 моль сульфата аммония и элюируют адсорбированные на колонке 508-субчастицы обратным градиентом конце.н йрации сульфата аммония.

Изобретение относится к молекулярной биологии и препаративной биохимии, а именно к способам получения нативных 30 и 50S рибосомных субчастиц. Целью изобретения является сохранение нативности рибосомных субчастиц и повышение их выхода. Для этого рибосомные субчастицы разделяют с помощью 2-этапной хроматографии на бутил-Тоеперл 650S: на первом этапе 70S рибосомы в диссоциирующем буфере, содержащем 500 мМ цитрата NA и 300 мМ MGCL₂, пропускают через колонку, промывают тем же буфером до исчезновения поглощения в промывных водах, а сорбированные 30S субчастицы элюируют разведенным в 5 раз исходным буфером. Промывные воды после первого этапа хроматографии, содержащие 50S субчастицы (до 90%), повторно хроматографируют на той же колонке в присутствии 150 мМ MGCL₂ и IM (NH₄)₂SO₄

элюция сорбированных 50S субчастиц проводилась обратным градиентом концентрации (NH₄)₂SO₄ - 0,8-0,25 М. Предлагаемый метод обеспечивает нативность рибосомальных субчастиц и их 80% выход. Метод может найти широкое применение как при исследовании аппарата трансляции генетической информации, так и для решения биотехнологических задач, связанных с биосинтезом биологических препаратов белковой природы разного назначения.