Способ хранения незрелых эмбрионов пшеницы Советский патент 1990 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве, в частности для быстрого получения селекционного материала, а также для создания новых высокопродуктивных сортов растений.

Необходимость использования в работах по клеточной селекции культуры незрелых эмбрионов вызвана тем, что геном зрелых зародышей более стабилен и слабо подвержен изменениям при действии различного рода мутогенных факторов. Это затрудняет проведение работ в области генной инженерии по получению новых сортов растений. Основной сложностью при работе с эм-f брионами, не завершившими свое развитие, является то, что они в искусственных условиях быстро теряют жизнеспособность и не могут храниться длительное время. Исходя из того, что для получения новых сортов растений необходимы десятки тысяч эмбрионов, вопрос об их хранении стоит остро и требует скорейшего решения. Получение незрелых эмбрионов в полевых условиях в больших количествах ограни- чено вегетационным периодом, а в искусственных условиях требуются большие площади закрытого грунта для вы- ,раи51вания растений. Кроме того, при хранении эмбрионы теряют необходимые для клеточной селекции свойства.

Цель изобретения - повышение жи-зне- способности эмбрионов пшеницы.

Способ хранении незрелых эмбрионов пшеницы состоит в.их предварительной подготовке, дегидратацрш и заморажио:о

О5

о

4 СЛ

вании, при этом семена пшеницы через 16-20 сутки после самоопыления помещают в 0,3-0,75%-ный раствор диметил- сульфоксида (ДМСО)на 20-24 ч, после чего осуществляют дегидрататщю в вакуумном эксикаторе с CaCl при температуре (+2)-(+4)°С. При уменьшении влажности незрелых семян до 20-25% их криоконсёрвирзоот путем помещения в па ры жидкого азота, после чего погружают в жидкий азот. Отогрев проводят на водяной бане- при +40°С. Жизнеспособность эмбрионов определяют после отделения незрелых эмбрионов от семян и их культивирования на среде Гамбор- га.В.

Выбор температзфных параметров для дегидратации в интервале (+2) - (+4) С обусловлен тем, что именно в этих пределах температзф происходит предотвращение функциональных повреждений тканей незрелых эмбрионов при дегидратации.

Дегидрататщя незрелых эмбрионов при +105 С резко снижает жизнеспособность незрелых эмбрионов пшеницы вследствие повреждений, возникающих в результате нарушения ростовых процессов, обусловленных патологически- ми изменениями межклеточных взаимодействий и нарушением механизмов про- 1ницаемости мембранных структур клетки

Снижение жизнеспособности незрелых семян при дегидратации при температуг pax ниже 0°С свидетельствует о том, что часть слабосвязанной с макромолекулами воды, находящейся в эмбрионе, замерзает и образует 1фисталлы льда, которые повреждают клеточные мембраны При размораживании этот лед может ре- кристаллизоваться и вызвать еще большие повреждения клеток. Обезвоживание незрелых семян пшеницы до 20-25%-ной влажности обусловлено тем, что при более низких или более высоких уровнях содержания воды происходит повреждение жизненно важных-процессов, определяющих жизнеспособность эмбрионов после криоконсервации в условиях жидкого азота.

Проведение двухэтапной криоконсервации обеспечивает полную сохранность жизнеспособности эмбрионов. В случае проведения прямого погружения незрелых семян в жидкий азот происходит повреждение эмбрионов. Это связано с тем, что часть воды, составляюи1ая подвижный компартмент слабосвязан-

|о 15

0

5 о

.,. 5

5

ной воды, может локально кристаллй зоваться и повреждать внутреннюю организацию клетки.

В результате проведенных исследований установлено, что для сохранения жизнеспособности эмбрионов пшеницы важными являются следуюш;ие условия подготовки незрелых эмбрионов пшеницы к хранению: осуществление обработки на 16-20 сутки после самоопыления; оптимальной является концентрация криопротектора в пределах от 0,3 до 0,75%; время инкубатщи незре- . лых зародьшей в растворе криопротектора составляет 20-24 ч.

Пример 1. Проводят исследование опытных образцов семян пшенитц 1 Харьковская 11. Растения выращивают в полевых условиях. Через 14,16,18, 20,22 суток после самоопыления незрелые семена, помещают в 0,1; 0,3, 0,5; 0,75; 1,0%-ный раствор ДМСО на 22 ч. После этого семена дегидратируют при температуре в вакуумном эксикаторе на CaCl. При достижении влажности 20% семена замораживают путем, помещения в пары жидкого азота, а затем непосредственно помещают в жидкий азот. Отогрев проводят при температуре +40 с на водяной бане. Жизнеспособность отделенных от незрелых семян эмбрионов определяют путем подсчета количества каллусов на среде Гамборга В через 7 дней рекультивирования.

Результаты исследований-жизнеспособности незрелых эмбрионов пшеницы сорта Харьковская 11 при инкубации в растворах ДМСО, %, представлены в табл. 1.

Пример 2. Растения пшеницы сорта Харьковская 11 через 18 суток после самоопьшения исследуют в эксперименте. Отделенные от растений незрелые семена погружают в 0,5%-ньй раствор ДМСП на 18,2:), 22,24,28 ч, а затем в вакуумном эксикаторе дегидратируют над CaCl при+3°С. Далее экс- перимент проводят аналогично указанно- му в примере 1. Результаты эксперимента представлены в табл. 2.

Пример 3. Растения пшеницы сорта Харьковская 11 через 18 суток после самоопыления исслед-уют в эксперименте. Отделенные от растений незрелые семена погру :сают в 0,5%-ньй раствор ДМСО, а затем-в вакуумньй эксикатор и дегидратируют над CaClg в холодильнике при температуре -2, о, + 2, +3, +4, . Далее эксперимент проводят аналогично примеру 1. Результаты эксперимента представлены в табл. 3.

Как свидетельствуют данные, приведенные в табл. 1-3,- наилучшие результаты получены при работе с незрелыми эмбрионами через 18 суток после самоопыления, которые инкубируют в 0,5%-ном растворе ДМСО в течение 22 ч при дегидратации в температурном интервале от +2 до .

Для подтверждения эффективности способа определяют жизнеспособность незрелых эмбрионов пшени1ды согласно способу-прототипу и предлагаемому способу после криоконсервации.

Сравнительные данные жизнеспособности незрелых эмбрионов после крио-. консервации согласно способу-прототипу и предлагаемому способу представлены в табл. 4,

1606045

10

15

ноценных незрелых эмбрионов, необходимых для клеточной селекции, что спо собствует ускорению работ по селекции новых сортов растений. Кроме того, способ позволяет осуществлять крио- консерва1даю незрачых эмбрионов и их .хранение на протяжении длительного Периода времени с высоким уровнем жизнеспособности, что имеет важное значение для сохранения наследственных- признаков растений.

Формула изобретения

20

Способ хранения незрелых эмбрионов пшеницы, включаю1 1ий их предварительную подготовку, дегидратацию и замораживание, отличаю щи й- с я тем, что, с целью повьппения жизнеспособности эмбрионов, предварительную подготовку осуществляют путем помещения эмбрионов, взятых на

,.. 20 сут после самоопьшения, в

Как свидетельствуют данные табл.4, -25 0,30-0, 75%-ньй раствор диметилсульфоксида на 20-24 ч, дегидратацию про- . водят при температуре +2 - 4 с и замораживание осу1чествляют путем двух- , этапной криоконсервации сначала в парах, а затем непосредственно в жид-.

предлагаемый способ более эффективен. Выход жизнеспособных незрелых эмбрионов, обрабатываемых по предлагаемому способу, превышает выход по способу- прототипу на 56%.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличивать выход пол30

ком азоте.

,

1606045

ноценных незрелых эмбрионов, необходимых для клеточной селекции, что способствует ускорению работ по селекции новых сортов растений. Кроме того, способ позволяет осуществлять крио- консерва1даю незрачых эмбрионов и их .хранение на протяжении длительного Периода времени с высоким уровнем жизнеспособности, что имеет важное значение для сохранения наследственных- признаков растений.

Формула изобретения

20

ксида на 2 водят при мораживани этапной кри парах, а за

ком азоте.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к селекционно-генетическим исследованиям, и может быть использовано в сельском хозяйстве при создании новых сортов. Целью изобретения является повышение жизнеспособности эмбрионов пшеницы. Эмбрионы, взятые на 16-20-е сутки после самоопыления, помещают на 20-24 ч в 0,30-0,75%-ный раствор диметилсульфоксида, после чего проводят дегидратацию при 2-4°С, затем осуществляют двухэтапную криоконсервацию сначала в парах, а затем непосредственно в жидком азоте. 4 табл.

эмбрионов пшеницы сорта XapbKOBCKa« l 1 е- рез 18 суток после самоопьшения, инкубация в 0,5%-ном растворе ДМСО, А ПО отношению к контролю

Таблица 1

1606045«

ТаблицаЗ

Жизнеспособность незрелых эмбрионов пшеницы сорта Харьковская 11 через 18 суток после самоопыления, инкубация в 0,5%-ном растворе ДМСО, %

43,4 (100%) 67,8

(156,2%) Р 0,01

Редактор С.Лисина

Составитель В.Демкин

Техре,п; М.Дидык Корректор Н.Король

Заказ 3504

Тираж 416

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5.

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

Таблиц а4

Подписное