Штамм бактерий BacILLUS ceReUS-продуцент протеолитических ферментов с тромболитическим действием Советский патент 1990 года по МПК C12N1/20 C12N9/54 C12N9/68 

Иэобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству Ферментов, и касается нового штамма бактерий, продуцирующего внеклеточную протеиназу с тромболитическим действием.

Цель изобретения - получение штам- Md спорообразующих бактерий, обладающего более высокой протеолитической и тромболитической активностью.

Штамм бактерий Bacillus cereus ВК1ШВ-4215 (ИНМИ ПИ-59) выделен из почв Нечерноземья.

Морфологические признаки. Грампо- ложительная палочка размером 1,2 - 1,5 X 3-6 мкм, образует овальные споры с центральным и эксцентральным и зксцентральным расположением в клетке,

Культуральные признаки. Мясопеп- тонный агар (МПА) - колонии круглой формы, диаметром 10 мм, непрозрачные, матовые, светло-кремовые, профиль плоский, край местами лопастной.

О)

яяЛ,

сд

МПА сусло-агар (1:1) - колонии светло-кремовые, матовые, гладкие. Край более зернистый.

Биохимические признаки. Каталазу образует. Клетки содержат внутриклеточные глобулы, не окрашиваемые фук- рином. Рост при 7% NaCl +, Крахмал |гидрализует. Казеин гидролизует. 1 Подвижность. Клетки молодой куль- |туры подвижны.

Отношение к углеводам и спиртам, 3 глюкозы, сахарозы, мальтозы кис- оту образует,.газ не образует, из |арабинозы, ксилозы, галактозы, лак- |Тозы, маннита кислоту не образует. Нитраты восстанавливает в нитриты. Желатину активно разжижает. Лецитина ная реакция положительная. Анаэробны рост отсутствует.

Отношение к лизоциму. Растет на 0,001% лизоцима.

Тирозин разрушает.

Температура роста: минимальная

h

, максимальная 35-4О°С.

При культивировании штамма Bacil- ilus cereus ВКПМ В-4215 засев производят .вегетативнЕлми клетками, выращен- |ными в течение 18 ч на МПА. Культуру ;вьфащивают в жидкой питательной ере- де при 28-30°С в течение 24-28 ч, ;культуральная жидкость (после центрифугирования)- разрушает экспериментально полученные тромбы крови человека в опытах in vitro за 30-90 мин Протеолитическая активность, определенная по методу Кунитца, достигает 50-110 ПЕ/мл, а при определении по модифицированному методу Анеона с :казеинатом натрия Протеолитическая активность достигает 12,9 ед/мл. Среда для культивирования штамма имеет следующий соста %: мальтоза или картофельный крахмал 2-4; (NH4)HP04: 1-1,4; кукурузный экстракт 0,5-1,0; СаСЦ 0,01-0,1; MgSO.4. 0,05-0,1, КС1 0,1-0,2; ЕпЗОф 5-10 мг/л, вода водопроводная остальное.

Штамм хранят в виде лиофильно вы- сушенной культуры, а также на агариз ванном МПА или картофельном агаре с 2% глюкозы, под вазелиновым маслом или глицерином.

Штамм не обладает гемолитической и коллагеназной активностью, не патогенен.

Пример 1. Штамм В,cereus ИНМИ ПИ-59 выращивают 18 ч на МПА.

5 0

5

о с о 5

Q

Засев проводят вегетативными клетт- ками.

в качестве ферментационной используют среду следующего состава, %: мальтоза 2; ()2.НРО 4- 1,2; куку- рузньй экстракт 1; CaCl MgS04 0,05; KCl 0,015; вода остальное. Через 41 ч культивирования на качалке с 25 мл среды в колбах Эрленмейера на 250 мл при 30°С Протеолитическая активность достигает 58 ПЕ/мл, а время разрушения тромбов в опытах in vitro 90 мин.

Пример. 2. Состав среды и условия культивирования согласно примеру 1, но дополнительно вносят ZnSO. 0,01%. Через 1 час культивирования Протеолитическая активность 92 ПЕ/мл, а время разрушения тромбов крови 40 мин.

П р и м е р 3. Состав среды согласно примеру 2, но культуру выращивают в Ю литровом ферментере Биотек с рабочим объемом 6 л при перемешивании 1000 об/мин, аэрации воздухом 1 ,5:1 и температуре . Через 30 ч Протеолитическая активность достигает 100 ПЕ/мп, а тромбы растворяются за 50 мин.

Пример 4. Состав среды согласно примеру 2, но в качестве источника углерода вместо мальтозы используют 2% картофельного крахмала. Через 40 ч культивирования в .колбах на качалке активность про- теиназы достигает 110 ПЕ/мл, а при определении по модифицированному методу Ансона с казеинатом натрия 12,9 ед/мл тромбы крови растворяются через 30 мин.

Пример 5. Состав среды согласно примеру 3, но в питательную среду вместо мальтозы вносят 4% крахмала. Через 24 ч культивирования в ферментере АК-210 с рабочим объемом 6 л, перемешивании 600 об/мин, и аэрации 2:1 Протеолитическая активность 86 ПЕ/мл, а время растворения тромбов 60 мин.

Пример 6. Состав среды согласно примеру 4, но культуру выращивают в 10-литровом ферментере АК-210 при аэрации 2:1, перемешивании 600 об/мин, с подтитровкой 10% NaOH до рН 7,0. Через 24 ч Протеолитическая активность 59 ПЕ/мл, а тромбы растворяются за 40 мин,

рез 30 ч культивирования протеоли- тическая активность 90 ПЕ/мл, а время растворения тромбов 30 мин.

П р и м-е р 7. Состав среды согласно примеру 4, но культивирова,- ние проводят в ферментере АК-210 бе подтитровки щелочью, аэрация 1:1, скорость перемешивания 600 об/мин. Через 48 ч протеолитическая активность 76 ПЕ/мп, время растворения тромбов крови 60 мин.

Осаязденный сульфатом аммония и очищенный методом гель-фильтрации, а затем лиофильно высзппенный ттрепарат имеет активность 16 ПЕ/мг препарата. Раствор фермента с содержанием препарата 5 мг/мл растворяет экспериментально полученные тромбы крови за 60 мин.

0

5 0

776 .

Предлагаемый штамм В. cereiPs ВКПМ В-4215 позволяет получать в течение 24-42 ч протеазы с высокой активностью в культуральной жидкости 50-110 ПЕ/мл, разрушающих экспериментально полученные тромбы крови в опытах in vitro за 0,5-1 ч.

Протеиназа, выделяемая штаммом В. cereus ВКПМ В-4215, может быть использована в медицинской промышленности для получения препаратов, необходимых в лечении тромбоэмболичес- ких заболеваний.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus cereus ВКПМ В-4215 - продуцент протеолити- ческих ферментов с тромболитическим действием.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству ферментов и касается нового штамма бактерий, продуцирующего внеклеточную протеинаду с тромболитическим действием. Цель изобретения - получение штамма скорообразующих бактерий, обладающего более высокой протеолитической и тромболитической активностью. Штамм BACILLUS CEREUS ВКПМВ-4215 выделен из почв Нечерноземья и продуцирует в течение 24-42 ч ферменты с высокой протеолитической и тромболитической активностью. Протеолитическая активность культуральной жидкости достигает 50 - 110 ПЕ/мл, а время разрушения экспериментально полученных тромбов крови в опытах IN VITRO составляет 0,5 - 1 ч. Штамм не патогонен и не обладает гемолитической и коллагеназной активностью. Выделенный штамм может быть использовано для получения препаратов, используемых в лечении тромбоэмболических заболеваний.