Штамм актиномицета SтRертомUсеS LaVeNDULae - продуцент протеолитических ферментов Советский патент 1992 года по МПК C12N9/52 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения протеолитических ферментов.

Известен продуцент протеолитических ферментов Actinomyces spheroides M8-2, который при культивировании на среде, содержащей глюкозу, цитрат натрия, сернокислый аммоний, сернокислое железо, имеет протеолитическую активность культу- ральной жидкости 2,48-2,76 ПЕ/мл, а лиофи- лизированного препарата - 2,76-3,3 ПЕ/мг (в 1 мкМ тирозина).

Недостатками данного продуцента являются невысокая протеолитическая активность культуральной жидкости и осажденного из нее препарата, а также низкая тромболитическая активность препарата (10 мг препарата растворяют тромб за 1ч).

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является штамм Streptomyces caligosus DS 14486. При культивировании на питательной среде, содержащей пептон, дрожжевой экстракт, агар-агар, глюкозу, при рН 6,5 в течение 96 ч получают культуральную жидкость с активностью 20 ПЕ/мл и осажденный из нее ферментный препарат с активностью 8-10 ПЕ/мг (в мкМ тирозина).

Недостатками штамма являются невысокая протеолитическая активность, обогащенная питательная среда и длительное время культивирования.

Цель изобретения - получение штамма актиномицета Streptomyces lavendulae ИНVJ

СО СЛ 00 О- 4

MH-SV-36 - высокоактивного продуцента протеолитических ферментов.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ-3-910. Штамм выделен в ИНМИ АН СССР из почвенного образца. Штамм хранят в лиофилизирован- ном состоянии на картофельном агаре или среде СР-1 с глюкозой.

Штамм характеризуется следующими морфологическими и физиолого-биохимиче- скими признаками,

Общая характеристика: аэробный, грамположительный, мицелиальный.

Мицелий воздушный.

Картофельный агар. Белые или серовато-розовые колонии (цвет лаванды), субстратный мицелий бежевого цвета, воздушный мицелий хорошо развит.

Овсяный агар. Колонии серовато-сиреневого цвета или белые, субстратный мицелий темно-бежевого цвета, воздушный мицелий хорошо развит.

Сусло-агар. Рост умеренный, колонии светло-коричневые с развитым воздушным мицелием.

МПА. Колонии бежевого цвета, воздушный мицелий слабо развит либо отсутствует.

Соевый агар. Рост хороший, колонии серо-розоватого цвета, субстратный мицелий коричневого цвета, воздушный мицелий хорошо развит.

Образование пигментов. Не наблюдается образование растворимых меланоид- ных пигментов на всех агаризованных и жидких средах, применяемых для культивирования.

Морфология спороносцев. Спороносцы в виде примитивных спиралей (1-2 витка), зрелые цепи содержат 10-15 спор, поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические признаки. Желатину разжижает, молоко коагулирует и пептонизирует. Сероводород и индол не образует. Нитраты не восстанавливает. В качестве источника углерода усваивает глюкозу, фруктозу, рафинозу, маннит, инозит. Слабо усваивает ксилозу, сахарозу и арабинозу. Источники азота: соли аммония и аминокислоты. На ломтиках картофеля и моркови наблюдается хороший рост. Оптимальная температура роста 26-28°С. При 37°С рост слабый, при 45° С рост отсутствует.

Штамм выращивают на дешевой питательной среде, содержащей, г/л: кукурузная мука 10-20; пептон 0,5-1,8; сухие кормовые дрожжи 0,5-1,0; MgSO/i -7Н20 0,02-0,04; водопроводная вода- рН среды

6,4-6,8. Среду разливают по 50 мл в колбы Эрленмейера объемом 250 мл. Количество посевного материала 10%. Выращивание проводят на качалке (200 об/мин) в течение

48-72 ч. Мицелий отделяют центрифугированием при 5000 об/мин. Протеолитиче- скую активность определяют по методу Кунитца и выражают в условных-единицах ПЕ/мл, мг(вмкМ тирозина). Фибринолити0 ческую активность измеряют по диаметру зон лизиса по методу Аструпа, а тромболи- тическую активность - по времени лизиро- вания in vitro экспериментально полученных тромбов из донорской крови.

5 Осаждение ферментов из культуральной жидкости осуществляют с помощью сульфата аммония. Полученный препарат лиофили- зируют и хранят в запаянной ампуле при -5°С.

0 Протеолитическая активность культуральной жидкости 40-97 ПЕ/мл, а лиофили- зированного препарата 40-80 ПЕ/мг. Фибринолитическая активность по плазми- ну 3000 ед./мл для культуральной жидкости

5 и5200ед/мг для препарата. В плазме крови активность полностью сохраняется. Полный лизис тромба in vitro культуральной жидкостью проходит за 30-40 мин, а 1 мг препарата - за 5-10 мин.

0 Пример 1. Штамм Streptomyces lavendulaeBKnM-S-910 выращивают на еле- { дующей питательной среде, г/л: кукурузная мука 10; пептон 0,5; сухие кормовые дрожжи 0,05; MgS04 7Н20 0,02; вода водопровод5 ная, рН 6,8. Среду разливают по 50 мл в колбы Эрленмейера объемом 250 мл. Количество внесенного посевного материала 10%. Выращивание проводят на качалке (200 об/мин) в течение 48 ч. Мицелий отде0 ляют центрифугированием при 5000 об/мин. Осаждение ферментов из культуральной жидкости осуществляют с помощью сульфата аммония 80% насыщения. Осадок отделяют центрифугированием при 5000 об/мин,

5 диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют. Протеолитическую активность определяют по Кунитцу и выражают в ПЕ/мл, мг (в мкМ тирозина).

Протеолитическая активность культу0 ральной жидкости 40 ПЕ/мл, осажденного препарата 68 ПЕ/мг. Фибринолитическая активность культуральной жидкости по Аст- рупу 2900 ед./мл, препарата 4800 ед./мг. Лизис тромба донорской крови in vitro куль5 туральной жидкостью проходит за 30 мин, а препаратом (1 мг, 740 мкг белка)- за 10 мин. Пример 2. Штамм Streptomyces lavendulae ВКПМ-3-910 выращивают на питательной среде, г/л: кукурузная мука 15,0; пептон 0,7; сухие-кормовые дрожжи 0,08;

MgS04 0,03; вода водопроводная, рН 7,0. Культивирование в течение 48 ч. Обработку культуральной жидкости и определение активностей проводят по примеру 1.

Протеолитическая активность культуральной жидкости 97 ПЕ/мл, а лиофилизи- рованного препарата 80 ПЕ/мл. Фибринолитическая активность культуральной жидкости достигает 3000 ед./мл, а препарата 5000 ед./мг. Лизис тромба культуральной жидкостью проходит за 25 мин, препаратом - за 5 мин.

Пример 3. Штамм Streptomyces lavendulae ВКПМ-5-910 выращивают на питательной среде, г/л: кукурузная мука 20; пептон 1,0; сухие кормовые дрожжи 1,0; MgS04 7Н20 0,05; вода водопроводная, рН 6,8. Среду разливают в колбы на 250 мл по 50 мл. Культивирование проводят на качалке (200 об/мин) при 28°С в течение 72 ч. Отделяют культуральную жидкость и осаждают из нее ферменты сульфатом аммония 80% насыщения. Осажденный осадок диа- лизуют и лиофилизируют.

Протеолитическая активность культуральной жидкости 90 ПЕ/мл, препарата 63

ПЕ/мг. Фибринолитическая активность культуральной жидкости 2800 ед./мл, препарата 4700 ед./мг. Лизис тромба культуральной жидкостью проходит за 35-40 мин,

а препаратом (1 мг, 800 мкг белка)-за 5 мин. Предлагаемый штамм позволяет получать высокую протеолитическую активность в культуральной жидкости и препарате при использовании дешевой,

экономически доступной питательной среды. Разрушение экспериментально полученных тромбов крови in vitro культуральной жидкостью проходит за 20- 40 мин, а препаратом - за 5-10 мин.

Протеазы, полученные с помощью предлагаемого штамма Streptomyces lavendulae ВКПМ-5-910, могут быть использованы в кожевенной промышленности для обработки шкур крупного рогатого скота, а также в

медицине для лечения тромбоэмболитических заболеваний, для обработки ожоговых

и гнойных ран, медицинских инструментов.

Формула изобретения

Штамм актиномицета Streptomyces

lavendulae ВКПМ-3-910 - продуцент проте- олитических ферментов.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоактив- ного штамма - продуцента протеолитических ферментов. Штамм актиномицета Streptomyces lavendulae BKAM-S- 910 на среде следующего состава, г/л: кукурузная мука 10-20; пептон 0,5-1,8; сухие кормовые дрожжи 0,5-1; сернокислый магний 0,02-0,04; вода водопроводная остальное, синтезирует активные внеклеточные протеолитические ферменты, обладающие широким спектром действия. Протеолитическая активность культуральной жидкости составляет по Кунитцу 40-97 ПЕ/мл, фибри- нолитическая активность 3000 ед./мл, а полный лизис тромба проходит на 30-60 мин. Лиофилизированный ферментный препарат, полученный из культуральной жидкости, характеризуется следующей протеолитической активностью: по казеину 40-80 ПЕ/мл, по фибрину 5200 ед./мл; при концентрации препарата 1 мг/мл тромб ли- зируется за 5-10 мин. Синтезируемые штаммом активные внеклеточные протеазы могут быть использованы в кожевенной, пищевой промышленности и в медицине. (Л С