Способ получения протеолитических ферментов для обработки кожевенного сырья Советский патент 1993 года по МПК C12N1/20 C12N9/58 C12N1/20 C12R1/56 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности получения специфических протеолитических ферментов микробного происхождения и может быть использовано в кожевенном производстве для обезволашивания кожевенного сырья.

Известны способы получения активных внеклеточных протеолитических ферментов для обработки кожевенного сырья, которые достигаются с помощью Aspergillus paraslticus, Asp. orizae, Bacillus subtilis(npo- тосубтилин ГЗх и ПОх), Streptomyces fradia, Streptomyces caligosus.

Недостатком способа получения проте- аз с помощью грибных культур является длительность их выращивания и более высокая устойчивость спор к физическим воздей- ствиям по сравнению с культурами актиномицетов. Из-за высокой вариабиль- ности бактериальных продуцентов необходима постоянная селекция активных культур, В обоих случаях используются сложные, дорогостоящие, труднодоступные питательные среды, включающие пищевые компоненты. Кроме того, полученные в результате щелочные протеазы, которые в настоящее время используются в СССР,

действуют на лицевую мембрану, в результате чего образуется велюрообразное лицо готовой кожи, т.е. происходит частичное разрушение ее поверхности.

Наиболее близким к предлагаемому нами является способ, достигаемый с помощью Streptomyces callgosus, Недостатком способа-прототипа является длительность выращивания штамма-продуцента (94 ч), дорогостоящая питательная среда с пищевыми компонентами, недостаточно высокая, протеолитическая активность внеклеточных протеаз, а также использование для обработки кожевенного сырья ферментного препарата, а не культурэльной жидкости, что обуславливает дополнительные затраты на реактивы и усложняет технологию.

Целью изобретения является способ получения протеолитических ферментов, используемых для обработки кожевенного сырья, предусматривающий выращивание продуцента Streptomyces iavenduiae на ферментационной среде, содержащей источники углерода и азота, а также сульфат магния и воду, с рН 6,4-6,8, до достижения максимальной активности, отличающийся тем, что с целью повышения кератиназной активности в комплексе протеолитических ферментов и удешевления в качестве источника углерода и азота используют кукурузную муку и белковый препарат № 1 (ГОСТ 17536-82) при следующем соотношении компонентов в г/л: кукурузная мука - 18-20, белковый препарат № 1 - 7-10, MgSO/з ТНаО - 0,02-0,04; водопроводная вода -до 1 л.

Поставленная цель достигается тем, что актиномидет Streptomyces iavenduiae ВКЛМ-З-ОЮ, культивирование которого осуществляют на питательной среде, содержащей (г/л): кукурузную муку - 18-20; белковый препарат № 1 (ГОСТ 17536-82, цена 27 коп/кг) - 7-10; Mg(Sp4)2 7M20 - 0,02- 0,04; воду водопроводную, при рИ 6,4-6,8, температуре 26-28°С в течение 48-72 ч.

Посевной материал выращивают на питательной среде следующего состава (г/л): кукурузный экстракт - 8,0-10,0; крахмал - 4,0-5,0; мел технический - 4,b-5,0; NaCI - 4,0-5,0; (NN4)2 S04 - 4,0-5,0; вода водопроводная, рН 6,4-6,8, температура 26-28°С1 время культивирования 24-48 ч, на качалке {180-200 об/мин). Посевной материал вносят в количестве 10 об. % + 0,1,

Для определения протеолитической активности культуральную жидкость отделяют от мицелия центрифугированием, фильтрованием или сепарированием. Внеклеточную протеолитическую активность определяют по модифицированному методу

Кунитца и выражают в ПЕ/мл. Протеолитическая активность культуральной жидкости составляет 40-90 ПЁ/МЛ по Кунитцу. Отличительными признаками данного способа является то, что в качестве продуцента используют актиномицет Streptomyces Iavenduiae ВКПМ-8-910 (ИНМИ-36-SI) культивирование которого проводят в течение 47-72 часов при 26-28°, рН 6,4-6,8, на

питательной среде, содержащей (г/л): кукурузную муку- 18-20; белковый препарат N 1 - 7,0-10,0; MgS04 - 0,02-0,04; воду водопроводную. При температуре ниже и выше указанных пределов рост культуры замедляется или прекращается. При рН ниже 6,4 и выше 6,8 наблюдается резкое снижение активности. При сокращении (менее 48 часов) или увеличении времени выращивания (более 72 часов) активность также уменыиается, При лабораторных испытаниях в барабанчиках на 3 л проводят мягчение шкурок крупного рогатого скота мокросоленого способа консервирования по действующей технологии. Затем вводят культуральную

жидкость при рН 6,4-6,8 и наблюдают за процессом обезволашивания во времени.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Берут культуру актиномецета Streptomyces Iavenduiae ВКПМ-S- 910, В колбы Эрленмейера на 250 мл вносят по 50 мл питательной среды, состоящей (г/л): кукурузной муки - 20, белкового препарата Чз 1 - 10, MgS04 7Н20 - 0,04,

водопроводной воды. Устанавливают рН 6,8. Питательная среда для посевного материала, который вносят в колбы в количестве 10% от общего объема, состоит (г/л) из: кукурузного экстракта - 10; крахмала - 5, мела

технического - 5; NaCI - 5; ( 5, воды водопроводной, рН 6,8, Выращивание ведут при 28°С на качалке (200 об/мин) в течение 48 ч. Выросшую биомассу отделяют центрифугированием и определяют протеолитическую активность культуральной жидкости. Она составляет 62 ПЕ/мл по Кунитцу и 5,7 ед/мл по Ансону.

Культуральную жидкость используют для обработки кожевенного сырья в лабораторных условиях. В барабанчиках на 3 л проводят мягчение шкурок крупного рогатого скота мокросоленого способа консервирования по действующей технологии. Отмока 1-я. Температура 30-35°С, жидкостной коэффициент (ЖК) 2,5. Продолжительность 1 час В барабанчики подают воду (1,5). Вносят сульфид натрия - 1 г/л, ПАВ - 1 г/л и опускают шкурки с волосяным покровом.

Мягчение. Подают воду (1,5 л), температура 30°С, ЖК 2,5. Культуральная жидкость из расчета - на 1 г сырья ед/мл ПА (по Ансону). На 600 г сырья вносят 22 мл куль- туральной жидкости, через 5 часов сливают ванну. Шкурки полностью обезволошены. Шерсть сохранена. Мездра удаляется. Шкурки эластичные, мягкие, с хорошей по- тяжкой. Лицевая поверхность кожи нешероховатая,

Пример 2. Берут культуру актиномице- та Streptomyces lavendulae ВКПМ-5-910. В ферментеры с рабочим объемом 6 л вносят по 5 л питательной среды следующего состава (г/л): кукурузная мука - 18, белковый препарат № 1 - 8,0; MgSCM 7Н20 - 0,2; вода водопроводная, рН 6,8. Затем вносят по 10% об. посевного материала, выращенного как в примере 1. Культивирование проводят при 28°С в течение 72 ч с использованием мешалки для аэрации (350 об/мин). Выросшую биомассу отделяют от культуральной жидкости с помощью сепаратора. Протеолитическая активность культуральной жидкости составляет 90 ПЕ/мл по Кунитцу и 8,7 ед/мл по Ансону.

Культуральную жидкость используют в полупромышленных условиях для обработки кожи крупного рогатого скота для низа обуви. Промытое сырье подвергают отмоке, мездрению и обработке нейтральной проте- азой с расходом 0,2% при 38°С, ЖК 10, в течение 5 ч. После этого дополнительно обрабатывают при ЖК 0,7, температуре 28°С, составом, содержащим 0,6% сульфида натрия и 1,2% гидроксида кальция, в течение 3 ч. Затем разбавляют водой до ЖК 1,5 и обработка продолжается в течение 8 ч. Последующий порядок проведения процессов операций по технологии производства , кож для низа обуви.

Шкурки полностью сохранены, обезволошены. Шерсть сохранена. Шкурки эластичные, мягкие, с хорошей потяжкой. Лицевая поверхность кожи гладкая.

П р и м е р 3. Берут культуру актиноми- цета Streptomyces iavendulae ВКПМ-5-910. В колбы Эрленмейера на 250 мл вносят по 50 мл питательной среды, состоящей (г/л): кукурузной муки - 18; белкового препарата № 1 - 7; MgS04 7H20 - 0,02; воды водопроводной при рН 6,4, температуре 26°С.

Питательная среда для посевного материала, который вносят в колбы в количестве 10% от общего объема, состоит (г/л): кукурузного экстракта - 8,0; крахмала - 4,0; (NH 02S04 - 4,0; воды водопроводной, рН 6,4, температура 26°С.

Выращивание ведут на качалке (200 об/мин), в течение 48 ч. Выросшую биомассу отделяют центрифугированием и опреде- ляют протеолитичёскую активность культуральной жидкости. Она составляет 40 ПЕ/мл по Кунитцу и 3,7 ед/мл по Ансону. Культуральную жидкость используют для обработки кожевенного сырья в лабораторных условиях, как в примере 1, из расчета на

0 1 г сырья 1 ед/мл ПА (по Ансону). Через 6 ч сливают ванну. Шкурки полностью обезволошены. Шерсть сохранена. Мездра легко удаляется. Шкурки мягкие, нешероховатые, с хорошей потяжкой.

5П р и м е р 4. Берут культуру актиноми- цета Streptomyces lavendulae ВКПМ-5-910. В колбы Эрленмейера на 250 мл вносят 50 мл питательной среды, состоящей (г/л): кукурузной муки - 20, белкового препарата №

0 1 - 10; MgSCM 7Н20 - 0,4; водопроводную воду. Устанавливают рН 6,8. Температура 28°. Выращивание ведут на качалке (200 об/мин) в течение 72 часов.

Посевной материал выращивают на пи5 тательной среде следующего состава (г/л): кукурузный экстракт - 10, крахмал - 5, мел технический -5, NaCI-5, (NH4), вода водопроводная при рН 6,8. Вносят в колбы с ферментационной средой в количестве

0 10% от общего обьема.

Выросшую биомассу отделяют путем сепарирования и определяют протеолити- ческую активность культуральной жидкости. Она составляет 87 ПЕ/мл по Кунитцу и 7,8

5 ед/мл по Ансону. Культуральную жидкость используют для обработки кожевенного сырья в лабораторных условиях, как в при- мере 1 и 3, из расчета на 1г сырья 1 ед/мл ПА (по Ансону). Через 8 ч сливают ванну.

0 Шкурки полностью обезволошены, шерсть, сохранена; мездра легко удаляется, шкурки мягкие, эластичные, гладкие, с хорошей потяжкой, Качество кожи идентично с полученными ранее по традиционной технологии и

5 удовлетворяют требованиям ГОСТа.

Протеолитические ферменты, получаемые с помощью предлагаемого способа, могут использоваться при обработке кожевенного сырья как для верха, так и для

0 низа обуви. Ферментативный способ пол- . учения кожи для низа обуви предлагается впервые, Применение предлагаемого способа позволяет получать в 2-4,5 раза по Кунитцу и в 2,5 раза по Ансону более высо5 кую протеолитичёскую активность, чем в способе-прототипе, в 2 раза менее продолжительный период выращивания продуцента при использовании дешевой, простой питательной среды, не содержащей пищевые компоненты. Высокая протеолитичеекая активность дает возможность использовать для обезволашивания и мягчения кожевенного сырья .культу ральную жидкость, а не осажденный из нее ферментный препарат, как в способе-прототипе. При использовании культуральной жидкости при рН 6,4-6,8 достигается удешевление и ускорение процесса обезволашивания, сокращение обычного цикла отмоко-зольных процессов для кож низа обуви, ускорение процесса диффузии при додубливании органическими растворителями. Снижается расход извести и сульфида натрия, уменьшается загрязненность сточных вод предприятий. Ф о р м у л а и з о б р е те н и я Способ получения протеолитических ферментов, для обработки кожевенного

0

5

сырья, предусматривающий выращивание продуцента Streptomyces lavendulae ВКПМ-5-910 до достижения максимальной активности на ферментационной среде, содержащей источники углерода и азота, сульфат магния и воду, отличающийся тем, что, с целью повышения кератиназной активности и удешевления способа, в качестве источника углерода и азота используют кукурузную муку и белковый препарат № 1 при следующем соотношении компонентов, г/л:

кукурузная мука18-20;

белковый препарат № 1 7-10;

сульфат магния

семиводный0,02-0,04;

водопроводная вода до 1 л.

Использование: биотехнология, в частности получение ферментов микробного происхождения и может быть использовано в кожевенном производстве для обработки кожевенного сырья. Сущность изобретения: способ предусматривает выращивание продуцента Streptomyces lavendulae ВКПМ S-910 на ферментационной среде, содержащей кукурузную муку, белковый препарат № 1 /ГОСТ 175-36-82/, сульфат магния и воду при следующем соотношении компонентов, г/л: кукурузная мука 18-20; белковый препарат № 1 7-10; сульфат магния семиводный 0,02-0,04; водопроводная вода до 1 л. Предложенный способ позволяет получить у продуцента коллагеназную активность 4-6 ед, лей/мл, а кератиназнуго активность 0,8-2,0 ед/мл, что превышает такие же активности в известном способе в 40 и 100 раз соответственно и приводит к полному обезволашиванию кожевенного сырья за несколько часов.