СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ГИДРОЛИЗА СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/14 C12N9/58 C12N9/58 C12R1/645 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения протеолитического препарата для гидролиза структурных белков: коллагена, кератина, эластина. Структурные белки - фибриллярные протеины, склеропротеины - наиболее устойчивы к действию физико-химических факторов и не подвергаются протеолизу пищеварительными ферментами человека и животных. Протеазы структурных белков в отличие от других протеолитических ферментов способны гидролизовать эти белки, характеризующиеся своеобразным составом на уровне первичной структуры, прочными молекулярными и надмолекулярными связями вторичной, третичной и четвертичной структур.

Известны протеазы микробиологического происхождения, позволяющие расщеплять коллаген и кератин, в частности, из микромицетов родов Aspergillus, Penicillium, Keratinomyces; актиномицетов (А. albus, A. griseus), стрептомицетов (S. fraidiospirallis, S. griseus, S. fulvoviridis), бактерий Pseudomonas, Clostridium histolyticum, и др. (1). Известны также коллагеназы грибов Trichophyton schoenleinii, кератиназы Microsporum canis и других дерматофитов (2, 3). Эластазная активность установлена у Trichophyton verrucosum, Microsporum gypseum (4). Однако при наличии относительно широкого спектра потенциальных продуцентов указанных ферментов последние различаются способом воздействия на расщепляемые белки, разной скоростью и продуктивностью реакции с образованием разных комплексов конечных продуктов.

Несмотря на востребованность в разных областях промышленности протеолитических ферментных препаратов, гидролизующих структурные белки, способы их выделения не нашли широкого применения.

В настоящее время с этой целью используют способ получения коллагеназы из краба (5). Способ имеет ограниченные возможности для промышленного производства, а получаемый этим способом фермент дефицитен и дорог.

Известен способ получения протеолитических ферментов для обработки кожевенного сырья, использующий в качестве продуцента Streptomyces lavandulae ВКПМ S-910. Протеолитическая активность культуральной жидкости составляет 40-90 ПЕ/мл по Кунитцу и 3,7-8,7 Е/мл по Ансону, причем коллагеназная активность с нингидрином составляет 4-6 Е/мл, а кератиназная - 0,8-2,0 Е/мл (6).

К недостатку способа следует отнести недостаточно широкую специфичность продуцируемого комплекса в отношении структурных протеинов, а также наличие питательной среды, содержащей пищевой компонент.

Задачей изобретения является изыскание микроорганизмов - продуцентов экзоферментного протеолитического комплекса, имеющего высокую коллагеназную, а также явно выраженную кератиназную и эластазную активности с целью создания препарата, гидролизующего структурные белки.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в увеличении количества протеаз, способствующих гидролизу структурных белков и специфической активности комплекса протеаз структурных белков (склеропротеаз) в культуральной жидкости или поверхностной культуре. При этом достигается оптимизация состава конечного продукта за счет уменьшения содержания балластных белков и его удешевление за счет использования среды простого состава (сусло-агара, сусло-бульона).

Поставленная задача решается путем использования продуцента протеаз структурных белков (склеропротеаз) из числа грибов-дерматофитов. Посевную дозу гриба вносят в жидкую или на плотную питательную среду, культивируют более 20 суток при 28°С, после чего биомассу гриба (мицелий и микроконидии) удаляют. Оставшуюся культуральную жидкость подвергают стерилизующей фильтрации, высушивают лиофильно или предварительно дополнительно очищают традиционными методами и высушивают очищенный продукт. При поверхностном культивировании - с использованием плотной питательной среды - биомассу гриба снимают с поверхности, а оставшуюся агаровую матрицу экстрагируют водой или слабым солевым раствором путем встряхивания с несколькими порциями экстрагента. Полученные экстракты объединяют и также высушивают. Получают протеолитический препарат со степенью очистки Г3х.

Для определения ферментативной активности лиофильно сухих препаратов (Г3х) использовали следующие методы. Определение коллагеназной активности препаратов ферментов проводили с препаратом “азоколл” (изготовитель Calbiochem), кератиназной активности - с препаратом “кератин-азур” (Sigma), эластазной активности - “конго-рот эластин” (Sigma). Для проведения ферментативной реакции берут по 1,5-10 мг субстрата, 1,5-10 мг ферментного препарата, 1 мл Трис-буфера (рН 8,0-8,2). В контрольные пробы вносят только соответствующий субстрат и буфер (без ферментного препарата). Реакцию проводят при 37°С в течение 1 ч (на кератиназную активность - 24 ч), после чего пробы центрифугируют при 6-7 тыс. об/мин в течение 10 мин., и супернатанты фотометрируют при оптимальной длине волны. За единицу кератиназной активности брали изменение оптической плотности при 650 нм на 0,01, осуществляемой 1 мг фермента в 1 ч; за единицу эластазной активности - изменение оптической плотности при 490 нм на 0,01, осуществляемой 1 мг фермента в 1 ч; за единицу коллагеназной активности брали изменение оптической плотности на 0,1 при тех же условиях.

Для определения коллагеназной активности исходных образцов культуральной жидкости и экстрактов агаровой матрицы (фермент степени очистки Гх) в качестве субстрата брали 1%-ную суспензию коллагена, ферментацию проводили при тех же условиях в течение 5 или 17 ч: в пробирки отбирали по 0,1 мл культуральной жидкости; добавляли по 1,9 мл суспензии субстрата. Опытные пробирки выдерживали в термостате, после чего в каждую приливали по 2 мл 20%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ). При постановке контрольных проб реагенты вносили в обратном порядке: фермент, ТХУ, субстрат. Наличие коллагеназной активности устанавливали по накоплению аминного азота, которое определяли нингидриновым методом. За единицу активности принимали количество аминного азота, эквивалентное 1 мкмолю лейцина, освобожденному из субстрата при выбранных условиях ферментации (37°С, рН 8,0) в течение 1 ч.

В качестве продуцентов использовали штаммы грибов-дерматофитов из коллекции ФГУ ВГНКИ.

Пример №1. Во флакон с жидкой питательной средой, например сусло-бульоном, вносят посевную дозу чистой культуры гриба Trichophyton mentagrophytes, штамм 31. Культуру выращивают в термостате при температуре 28°С в течение 20 суток. Затем культуральную жидкость отделяют стерилизующей фильтрацией. Оставшуюся на фильтре культуру обеззараживают автоклавированием. Культуральную жидкость высушивали методом лиофилизации. Выход сухого препарата при этом составляет 10 мг/мл. После высушивания получают препарат с суммарной протеолитической активностью 4,8 Е/мг.

Пример №2. В литровую колбу с плотной питательной средой (сусло-агаром) вносят культуру Т. mentagrophytes штамм 23, культивировали в течение 20 суток при 28°С, после чего выросший газон гриба снимают скребком. Оставшуюся плотную питательную среду обмывают физиологическим солевым раствором и стерильно фильтруют через фильтр Зейтца. К оставшейся агаровой среде добавляют равный объем физиологического раствора хлорида натрия и экстрагируют метаболиты путем встряхивания на шуттель-аппарате в течение 15 мин. Экстракт сливают и также подвергают стерилизующей фильтрации. Экстракцию повторяют еще два раза. Все фильтраты объединяют лиофильно высушивают. Получают препарат с суммарной протеолитической активностью склеропротеаз 3,45 Е/мг.

Пример №3. На жидкой питательной среде выращивают культуру гриба Т. mentagrophytes, штамм 7400 при 28°С в течение 20 суток, после чего испытывают коллагеназную активность в отфильтрованной культуральной жидкости (без предварительного высушивания). Коллагеназная активность культуральной жидкости (Гх) составляет 27,5 Е/мл.

Пример №4. Штамм гриба Т. equinum 51 выращивают на сусло-бульоне в течение 20 суток и подвергают обработке как в примере 1 без высушивания. Фильтрат культуральной жидкости имеет коллагеназную активность, равную 15,1 Е/мл.

Пример №5. Во флакон с жидкой питательной средой (сусло-бульон + бульон Хоттингера) вносят посевную дозу культуры гриба Т. verrucosum, штамм 165 и инкубируют в течение 21 суток при 28°С. Культуральную жидкость освобождают от гриба как в примере №1 и испытывают на содержание ферментов. Коллагеназная активность составляет 39,9 Е/мл.

Пример №6 и 7. Штаммы Т. verrucosum 180 и 149 инкубируют аналогично примеру №1 и испытывают на содержание ферментов в культуральной жидкости. Коллагеназная активность составляет соответственно 13 и 12,4 Е/мл.

После лиофильного высушивания культуральной жидкости штамма 180 получают препарат с суммарной активностью склеропротеаз 7,7 Е/мг.

Примеры №8 и 9. Жидкую питательную среду засевают культурами грибов Microsporum canis, штаммы 68 и 17. Через 21 сутки культивирования отделяют среду роста (культуральные жидкости) и высушивают. Получают два препарата с общей активностью склеропротеаз соответственно 1,05 и 0,77 Е/мг.

Примеры №10 и 11. Штаммы Microsporum canis 3483 и 3498 инкубируют аналогично примеру №1, после чего испытывают на содержание ферментов в культуральной жидкости. Коллагеназная активность составляет соответственно 16,5 и 7,5 Е/мл.

Пример №13. Штамм Microsporum gypseum 6402 высевают на жидкую питательную среду (сусло-бульон) и культивируют 20 суток.

Культуральную жидкость отделяют и лиофильно высушивают как в примере №1. Коллагеназная активность в сухом препарате составляет 0,7 Е/мг.

Полученные результаты приведены в диаграмме на фиг.1 и 2. Значения коллагеназной активности для жидких ферментных препаратов, найденные по литературным источникам (диагр. 2), пересчитаны на 1 ч реакции.

Приведенные диаграммы подтверждают наличие протеолитической активности у всех изучавшихся видов дерматофитов: штаммов рода Trichophyton (Т. verrucosum, Т. equinum, Т. mentagrophytes), и Microsporum (M. canis, M. gypseum) - коллагеназной, кератиназной и эластазной. Диаграмма 2 иллюстрирует высокую коллагеназную активность ферментных препаратов, получаемых от изучавшихся штаммов, в сравнении с активностью препаратов-аналогов. Приведенные результаты показывают возможность использования указанных грибов в качестве продуцентов отдельных протеаз (например, коллагеназы) или комплекса протеаз структурных белков.

Список использованной литературы

1. Грачева И.М. и др. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. Учебное пособие для вузов. M., “Легкая и пищевая промышленность”, 1982, 240 стр.

2. Rippon J.W. Extracellular collagenase from Trichophyton schoenleinii. Journal of bacteriology, 1968, vol. 95, N1, pp.43-46.

3. Daniels G. The digestion of human hair keratin by Microsporum canis Bodin. J. Gen. Microbiol., 1953, vol. 8, pp.289-294.

4. Meevootisom V., Niederpruem D.J. Control of exocellular proteases in dermatophytes and especially Trichophyton rubrum. Sabouradia, 1979, vol. 17, pp.91-106.

5. А.И.Абдулов и др. Получение культуры клеток с помощью коллагеназы крабов. Тезисы докладов ВГНКИ, M., 2001, с.218-219.

6. SU 1778010, 15.01.1993.

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в различных областях промышленности. Способ получения протеолитического препарата включает культивирование штамма-продуцента из числа грибов-дерматофитов видов Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton verrucosum, Trichophyton equinum, Microsporum canis, Microsporum gypseum. Пригодными являются штаммы грибов, обладающие способностью продуцировать комплекс протеаз структурных белков (склеропротеаз) с общей протеолитической активностью не менее 0,7 Е/мг, в т.ч. коллагеназу 0,1-4,5 Е/мг; кератиназу 0,1-0,5 Е/мг; эластазу 0,5-1,9 Е/мг. Для культивирования используют простые среды, например сусло-агар или сусло-бульон. Продолжительность культивирования 20-24 сут. Изобретение обеспечивает увеличение специфической активности комплекса протеаз структурных белков (склеропротеаз) с увеличением скорости и глубины протеолитического расщепления специфических субстратов (склеропротеинов). 2 ил.

Способ получения протеолитического препарата для гидролиза структурных белков, характеризующийся тем, что осуществляют культивирование предварительно активированной культуры гриба-дерматофита, выбранной из вида Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton verrucosum, Trichophyton eguinum или Microsporum canis, Microsporum gypseum, отобранной по способности продуцировать коллагеназу, кератиназу и эластазу, выделение, очистку и высушивание с получением препарата, обладающего суммарной протеолитической активностью не менее 0,7 П Е/мг.