Способ получения токсоплазменного антигена Советский патент 1976 года по МПК A61B10/00 

1

Изобретение относится к области иммунохимии, в частности к способам получения биологических диагностических препаратов, а именно - антигена для серологической диагностики токсоплазмоза.

Известны способы получения антигенов для диагностики токсоплазмоза из инвазионного материала путем экстракции его эфиром н спирт-эфирно-фенольной смесью.

Однако этот способ трудоемок и длителен, при этом антиген, получаемый по известному способу, не дает четких положительных серологических реакций с сыворотками крови спонтанно или экспериментально зараженных токсоплазмой сельскохозяйственных и диких животных.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому изобретению является способ, включающий извлечение и отмывку токсоплазм от клеточных элементов исходного сырья, дезинтеграцию клеток токсоплазм ультразвуком и выделение из полученного ультразвукового лизата антигенной фракции изоионным фракционированием.

Однако этот способ также оказался неприемлемым для получения антигена из токсоплазм, так как получаемые антигенные препараты проявляют в серологических реакциях недостаточно выраженную снецифичность:

они дают положительные результаты не только с гомологичными токсоплазменными сыворотками крови, но и с антисывороткой на нативный перитонеальный экссудат здоровых белых мыщей, что указывает на наличие в антигенах балластных веществ, снижающих их активность и специфичность.

Цель изобретения состоит в разработке экспресс-способа получения стандартного однородного антигена с высокоактивными и специфическими свойствами, пригодного для использования в нескольких иммунологических реакциях: в реакции связывания комплемента (РСК), реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) и реакции яммунодиффузии в агаровом геле (РП-гель) для серологической диагностики токсоплазмоза.

Постановленная цель достигается тем, что в известном способе, включающем извлечение и отмывку токсоплазм от клеточных элементов исходного сырья, дезинтеграцию токсоплазм обработкой ультразвуком и выделение антигенной фракции изоионным фракционированием, ультразвуковую дезинтеграцию клеток токсоплазм проводят 2-3-х кратно с отделением лизата оболочек токсоплазм и выделением из него антигенной фракции изононным фракционированием при дополнительном воздействии на лизат ультразвуком с последующей очисткой антигенной фракции от

0

неспецифических балластных веществ добавлением к ней аятисыворотки.

Способ получения антигена заключается в следующем.

Для проведения способа необходимы следующие реактивы и растворы: натрий хлористый (х. ч.), едкий натр (х. ч.), серная или соляная кислота (х. ч.), 0,25, 0,5 и 1 н. растворы едкого натра, 0,25, 0,5 « 1 н. растворы серной ИЛИ соляной кислоты 0,85%-ный раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

Получение исходного сырья. Материалом для получения токсоплазменпого антигена служит неритонеальный экссудат белых мыщей, зараженных эталонным щтаммом токсоплазм или одним из вирулентных щтаммов, выделенным от сельскохозяйственных животных. Для этого белых мышей весом 16-18 г партиями по 200-250 голов заражают перитонеальным экссудатом от исходных щтаммных токсоплазменных мыщей. Экссудат для заражения разводят стерильным физиологическим раствором так, чтобы в поле зрепия микроскопа (увеличение 15X40) были видны 1-3 токсоплазмы. Доза заражения мыщей- 0,2 мл. На 4-5 день после заражения мышей наркотизируют эфиром и стерильным шприцом из брюшной нолости извлекают перитонеальный экссудат. Брющную полость каждой мыши дополнительно промывают 0,5 мл физиологического раствора. Собранный материал проверяют на наличие токсоплазм и отсутствие посторонней микрофлоры путем микроскопирования мазков. После проверки экссудат центрифугируют в стерильных пробирках в течение 30-45 мин при 3-4 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок содержит токсоплазмы и примесь лейкоцитов и гистиоцитов перитонеального экссудата мыщей. Чтобы избавиться от этих клеточных балластных компонентов осадок ресуспензируют в 5-10 мл физиологического раствора и затем многократно пропускают через тонкую иглу щприца для разрущения клеточных элементов экссудата. К полученной взвеси добавляют 10-15 мл физиологического раствора, снова пропускают через иглу шприца и после этого центрифугируют при 2- 3 тыс. об/мин в течение 45-60 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а обработку осадка повторяют еще 2-3 раза, после чего отмытый осадок токсоплазм пригоден для приготовления антигена.

Градуированная дезинтеграция токсоплазм. Дезинтеграцию осуществляют в ноле ультразвуковых волн низкочастотного диспергатора (УЗДН) градуированно в три приема: первые две обработки проводят в физиологическом растворе, последнюю - основную - в дистиллированной воде.

В стеклянный сосуд с водяным охлаждением вносят 1-2 г отмытых токсоплазм, заливают 50-100 мл физиологического раствора и создают в контактной среде ультразвуковые колебания частотой 22-35 кгц и акустической мощностью 20-50 вт/см в течение 5-10 мин. Взвесь частично разрушенных токсоплазм центрифугируют при В-10 тыс.

об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость (лизат I) сливают, а к осадку добавляют 50-100 мл физиологического раствора и обработку токсоплазм повторяют также при частоте 22-35 кгц, но мощности 50-75 вт/см

и уже в течение 30-40 мин. Взвесь разрущенных токсоплазм центрифугируют нри 8- 10 тыс. об/мин 15 мин. Надосадочную жидкость (лизат II), представляющую собой солерастворимую нротоплазматическую часть

токсоплазм, отделяют от осадка оболочек токсоплазм, который промывают в дистиллированной воде 2-3-х кратным центрифугированием при вышеуказанном режиме. Отмытый осадок ресуспензируют в 20-30 мл дистиллированной воды, среду усредняют 0,25-0,5 н. раствором едкой щелочи в пределах рН 8,0- 8,2, переносят в сосуд для озвучивания и обрабатывают ультразвуком частотой 22- 35 КГЦ, мощностью 40-60 вт/см 5-10 мин.

Небольшое количество нерастворившегося осадка отделяют от жидкой части центрифугированием.

Полученная надосадочная жидкость - водный раствор оболочек токсоплазм (лизат

III)-является материалом для получения специфического токсоплазменного антигена.

Ультразвуковое изоионпое фокусирование и выделение специфической антигенной фракции. Фракционирование ультразвукового лизата III начинают с фокусирования балластных фракций, которые могут содержаться в лизате при недостаточно полной предварительной очистке токсоплазм и недостаточно- тщательном градуированном разделении токсоплазм ультразвуком на лизат III и неспецифические протоплазматические лизаты I и II. Для этого лизат III переносят в химический стакан на 50-100 мл и подвергают 2-3-минутному воздействию ультразвуковой частотой 22-35 кгц и мощностью 50-75 вт/см (без применения охлаждающей системы), что приводит к быстрому прогреванию обрабатываемой среды до оптимальной для последующего фракционирования температуры 35-40°С. Электрометрическим титрованием с помощью рН-метра и 0,5-1,0 н. раствора едкого натра лизат III подщелачивают до рН 10,5-11,5, в пределах которых фокусируется в виде мелких хлопьев небольшое количество осадка - антигенная фракция «А. Для полноты осаждения стакан с лизатом III дополнительно выдерживают в термостате при 37°С 20- 30 мин. Сформировавшийся осадок отделяют

15-20-минутным центрифугированием при 8-10 тыс. об/мин.

Надосадочную жидкость (лизат IV) снова прогревают ультразвуком до оптимальной температуры 35-40°С, медленной нейтрализацией 0,5-1,0 н. раствором серной кислоты

доводят рН среды до 9,0-9,5 и фокусируют антигенную фракцию :В:. Лизат IV выдерживают в термостате 20-30 мин, а затем центрифугируют. Из надосадочной жидкости (лизат V) аналогичным образом при рН 6,8- 7,2 осаждают третий осадок - антигенную фракцию «С и получают основной, очищеииый лизат VI, из которого ультразвуковым фракционированием выделяют ири рН 3,5-5,5 специфическую антигенную фракцию «/). После центрифугирования специфическую фракцию «D с помощью ультразвука растворяют в 20-30 мл дистиллированной воды при рН 8,0-8,2 и проводят последующую ее очистку.

Иммунохимическая очистка специфической антигенной фракции «/) проводится с помощью антисыворотки на нативный перитонеальный экссудат белых мыщей (на балластные вещества). Ее получают путем иммунизации кроликов иативиым перитонеальным экссудатом здоровых белых мышей. Мыщам интраиеритоиеально вводят по 0,2 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Через 30 мин насыщенный раствор вводят повторно в дозе 0,4-0,5 мл. По истечении одного часа от момента первого введения насыщенного раствора мышей наркотизируют, вскрывают и затем из брюшной полости извлекают шприцем экссудат. Собранный материал центрифугируют при 3 тыс. об/мии в течение 30 мин. Полученный материал вводят 4 раза кроликам в возрастающих дозах с интервалом в 2-3 недели между первой и второй инъекциями и в одну неделю между последующими (I цикл иммунизации). При первой инъекции материал вводят в смеси с дополнителем Фрейнда под кожу боковой поверхности туловища кролика. Остальные 2-3 инъекции материала производят внутримышечно без дополнителя Фрейнда. Реиммунизацию (И цикл иммунизации) проводят через 30-40 дней с момента последнего введения материала. Она состоит из одной или двух инъекций материала без дополнителя в мышцу бедра с интервалом 4-5 дней между введениями. На 7, 14 и 21 дни после последнего введения материала у животных берут кровь и проверяют титр сыворотки в РСК или РП в агаровом геле. Полный цикл иммунизации 4-5 месяцев, иосле чего антисыворотка готова для очистки специфической фракции «D.

Специфическую антигенную фракцию «D проверяют на чистоту преципитацией с антисывороткой на нативный перитонеальный экссудат белых мыщей (на балластные вещества). К пробиркам с прогрессивно уменьшающимся количеством антигенной фракции (0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 и 1,0 мл) добавляют по 0,5 мл цельной или разведенной (в зависимости от титра) антисыворотки на балластные вендества. Смесь в иробнрках тщательио перемешивают и инкубируют при 37°С в течеиие 1,5-2 час, а затем помещают иа 18-24 час в холодильник при 4°С. Контролями служат

антисыворотка и антигеиная фракция с физиологически.м раствором. Реакция иа балласт считается положительной, если в одной или нескольких проб1 рках отмечается преципитат (осадок). Если прецииитат отсутствует во всех иробирках (отрицательная реакция), то антигенную фракцию сразу же используют в качестве специфического токсоплазменного антигена. В случае поло}кительной реакции (наличия преципитата) по пробирке с макси.мальным количеством преципитата высчитывают необходимое количество антисыворотки для осаждения балласта и добавляют ее ко всему объему антигенной фракции. Смесь также инкубируют 1,5-2 час в термостате и выдерживают 18-24 час в холодильнике. Образовавшийся преципитат отделяют центрифугированием в течеиие 20-30 мин при 8- 10 тыс. об/мин. Из надосадочной жидкости ультразвуковым изоионным фокусированием при рН 3,5-5,5 выделяют очищенную специфическую антигенную фракцию.

Приготовление и стандартизация т о к с о и л а 3 м е н и о г о антигена. Осадок очищенной от балласта антигенной фракции «D иромывают в дистиллированной воде 2-3-х кратным ультразвуковым растворением при 0,8-8,2 и переосаждением при рИ 3,5-5,5. Отмытый осадок растворяют в 20-30 у.л дистиллированной воды при рН 8,0-8,2. Этот раствор антигенной фракции является специфическим токсоилазменным антигеном.

Стандартизацию антигена проводят по серологической активности титрацией с гиперимунными токсоплазменными сыворотками, Оитимальный рабочий титр антигеиа в РСК и РИГА 1 :20-- 1 :160, а для РП в агаровом геле - исходное разведение. Чувствительность токсоплазменного антигена по обнаружению специфических тoкcoплaз :eнныx антител в сыворотке крови гипериммунных, экспериментально зараженных и спонтанно больных животных характеризуется в РСК в разведении сыворотки 1 : 5 - i : 640 и в РИГ.4 1 ; 40 - 1 : 2560, а в РП в агаровом геле - одной линией преципитации.

Для стабилизации антиген лиофилизируют в рабочем титре с средой. В высушенном виде, в ампулах, он представляет собой мелкоиористую таблетку белого цвета, легко растворяющуюся в дистиллированной воде и физиологическом растворе. Срок годности лиофилизированного антигена 2-3 года.

Приготовлеиный по описанному способу токсоплазменный антиген испытан ко.миссионFO, апробирован в ВГИКИ и в И1ироком производственном опыте и показал высокую специфичность при серолог ческой диагиостике токсоплазмоза.

Формула изобретения

Способ получения токсоплазменного антигена для серологической диагностики, вклю7чающий извлечение и отмывку токсоплазм от клеточных элементов исходного сырья, дезинтеграцию токсоплазм обработкой ультразвуком и выделение антигенной фракции «зоионным фракционированием, отличающийся5 тем, что, с целью повыщения специфической активности антигена, ультразвуковую дезинтеграцию клеток токсоплазм проводят 2-38кратно с отделением лизата оболочек токсоплазм и выделением из него антигенной фракции изоионинм фракционированием при дополнительном воздействии на лизат ультразвуком с последующей очисткой антигенной фракции от неспецифических балластных не ществ добавлением к ней антисыворотки.