АДЪЮВАНТ Советский патент 1995 года по МПК A61K39/135 A61K35/06 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной вирусологии, а именно к масляным адъювантам.

Целью изобретения является снижение вязкости и реактогенности препарата и повышение его стабильности и иммуностимулирующих свойств.

П р и м е р 1. Адъювант отличается тем, что в его состав вводят полимер линейной структуры общей формулы
R_aR- Si O -- - O -- O SiR_aR
где либо R=CH₃, R'=C₆H₅, m=0-20, n=1-15, a=0-3, либо R=R'=C₂H₅, m=0, n=3-12, a=0 при следующем соотношении ингредиентов, мас. Полимер 85-95 Эмульгатор 5-15
Полимер бесцветная и прозрачная жидкость, химически инертная, взрывобезопасная, нетоксичная, не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки. Полимер растворим в ароматических хлорированных углеводородах, не растворим в низших спиртах и воде.

Полимер хорошо совместим с углеводородными маслами. Он не застывает при температуре выше -60^оС и сохраняет свойства при температуре выше 150^оС. Не содержит механических примесей, имеет концентрацию водородных ионов (рН) водной вытяжки 6-7. Для наших целей наиболее пригодны полимеры, где либо m= 0, n= 3, R= СН₃, R'=С₆Н₅, а=3 (полимер I), либо R=R'=C₂H₅, m=0; n=2-5, а=0 (полимер II).

Такие полимеры имеют вязкость при 20^оС 6-17 мм²/с, плотность при 20^оС 0,920 1,015 г/см³.

П р и м е р 2. Для экспериментальной проверки предлагаемого адъюванта готовят пять смесей ингредиентов, три из которых показали оптимальные результаты. Сведения об этом приведены в табл. 1.

При исследовании образцов эмульсионных иммунизирующих препаратов, приготовленных с использованием предлага- емого адъюванта, установлено, что при соотношении компонентов адъюванта 80:20 (мас.) препараты обладают повышенной вязкостью (более 3000 мм²/с), а также повышенной реактогенностью. Эмульсионные препараты на основе адъюванта, приготовленного из компонентов, взятых в соотношении 97:3 (мас.), являются нестабильными.

Препараты адъюванта получают при использовании различных эмульгаторов: Спана 80, пентаэритритолеата, арлацела, безводного ланолина и других, стабилизирующих обратные эмульсии.

Адъюванты готовят следующим образом. Эмульгатор растворяют в полимере в оптимальных соотношениях и стерилизуют общепринятыми методами: либо методом стерилизующей фильтрации с помощью пластин марок СФ, ЕКS, УАМ-150 и других при температуре около 40-50^оС, либо нагреванием в сушильном шкафу до 120-130^оС в течение 1-1,5 ч. Готовый адъювант представляет собой маслянистую жидкость цвета от светло-желтого до коричневого в зависимости от вида эмульгатора. Допускается опалесценция, которая не влияет на качество адъюванта. Вязкость такого адъюванта при 20^оС колеблется в пределах 7-18 мм²/с в зависимости от вязкости полимера. Готовый адъювант проверяют на реактогенность на белых мышах и хранят при комнатной температуре до момента использования.

Реактогенность предлагаемого адъюванта и его компонентов в сравнении с прототипом и его ингредиентами контролируют на белых мышах. Для этого группе мышей в количестве 10 голов массой 20 ±1 г каждая в одну из задних лапок подкожно в область стопы вводят образцы по 0,05 мл. Через 10 дней после введения задние лапки обрезают по скакательный сустав и взвешивают. Реактогенность (Р) определяют как процент образовавшейся массы опухоли лапок от введения образца по сравнению с контрольными лапками и выражают формулой
P 1 100 где Σ М_о сумма масс лапок опытной группы животных;
Σ М_к сумма масс контрольных лапок.

Результаты сравнительной оценки реактогенности различных масел и адъювантов представлены в табл. 2.

Из представленных в табл. 2 данных следует, что предлагаемые адъюванты и полимеры I и II обладают наименьшей реактогенностью для мышей в сравнении как с отечественным минеральных маслом, так и зарубежным маслом Маркол 52 и неполным адъювантом Фрейнда, используемыми для производства иммунизирующих биопрепаратов.

Кроме количественной характеристики, реактогенность предлагаемого адъюванта и полимеров изучают при подкожном введении в качественной пробе на крупном рогатом скоте, овцах, кроликах и при внутримышечном на свиньях и морских свинках. Результаты исследований приведены в табл. 3, где данные по изучению реактогенности полимеров I и II и на их основе предлагаемых адъювантов усреднены и обозначены словами "Полимер" и "Предлагаемый адъювант", так как свойства полимеров I и II близки.

Приготовление эмульсионной формы иммунизирующих препаратов с предлагаемым адъювантом сводится к приготовлению эмульсии типа воды в масле. Эмульсионные препараты получают путем эмульгирования равных частей полученного антигена и предлагаемого адъюванта с помощью коллоидных мельниц или других гомогенизаторов до образования эмульсии белого цвета.

В результате получают иммунизирующие препараты, нерастворимые в воде, жидкой консистенции, которые легко рассасываются с места введения, не вызывают образования абсцессов, обладают выраженной иммуногенностью для лабораторных и сельскохозяйственных животных. При испытании иммуногенной активности препараты вводят свиньям и мышам внутримышечно, а КРС кроликам и белым мышам подкожно, в некоторых опытах кроликам и белым мышам иммунизирующие препараты вводят внутримышечно.

В некоторых опытах предлагаемый адъювант испытывают в сочетании с минеральным сорбентом. Для этого сорбированный антиген механически перемешивают с предлагаемым адъювантом. Сорбированно-масляные препараты испытывают в опытах на белых мышах.

Из представленных в табл. 3 данных следует, что при подкожном и внутримышечном введении образцов предлагаемых полимера и адъюванта местные реакции у животных отсутствуют, или отмечают небольшие соединительно-тканные гранулемы, в то время как масляная основа, известный адъювант и неполный адъювант Фрейнда в большинстве случаев обладают повышенной реактогенностью: вызывают образование абсцессов.

Эффективность предлагаемого адъюванта проверяют в экспериментах на лабораторных и сельскохозяйственных животных в двух формах иммунизирующих препаратов: эмульсионной и сорбированно-масляной с использованием различных вирусных антигенов.

В лабораторных опытах авирулентность инактивированных антигенов контролируют на новорожденных мышах. При введении 20 мышатам-сосунам в дозе по 0,1 мл подкожно все антигены были авирулентны.

Проведены испытания на стабильность эмульсий образцов иммунизирующих препаратов на основе предлагаемого адъюванта. Результаты приведены в табл. 4.

При диспергировании водного антигена с соответствующим количеством адъюванта получают во всех случаях стабильные эмульсии типа воды в масле за исключением образца, в котором 1,5 мас. эмульгатора было недостаточно для получения стабильной эмульсии, а введение в состав эмульсии 10 мас. эмульгатора приводит к образованию высоковязких препаратов. Стабильность эмульсии контролируют путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 30 мин и хранении в термостате при 37^оС в течение 1 месяца. При такой проверке не отмечают отделения водной фазы и эмульсия сохраняет свои физические свойства. Эмульсии на основе предлагаемого адъюванта относятся к типу "вода в масле" и отличаются выраженной стабильностью и относительно невысокой вязкостью в широком интервале температур (от 4 до 25^оС), что выгодно отличает ее от препаратов на основе известного адъюванта и неполного адъюванта Фрейнда.

Таким образом, предлагаемый адъювант позволяет получать эмульсионные формы препаратов типа воды в масле невысокой вязкости, умеренной реактогенности и незастывающие при хранении при 2-6^оС.

П р и м е р 3. В первой серии опытов готовят два образца эмульсионной противоящурной вакцины из лапинизированного вируса А₂₂соответственно на основе предлагаемого и известного адъювантов. Количество антигена (146 частиц) в образцах вакцин было равноценным. Результаты иммуногенности на взрослых белых мышах представлены в табл. 5.

Из табл. 5 видно, что вакцина на основе предлагаемого адъюванта значительно активнее вакцины на основе известного адъюванта.

Во второй серии опытов готовят два образца эмульсионной, два образца сорбированно-масляной противоящурной вакцины из концентрированного лапинизированного вируса А₂₂ соответственно на основе предлагаемого и известного адъювантов. Кроме того, из этого антигена готовят противоящурную сорбированную вакцину. Количество (146 частиц) компонента во всех образцах вакцин было одинаковым. Результаты иммуногенности на взрослых белых мышах представлены в табл. 6.

Из табл. 6 видно, что наиболее выраженной иммуногенностью обладают вакцины, приготовленные на основе полимера. При этом установлено, что эмульсионная вакцина с предлагаемым адъювантом более чем в три раза активнее препарата на основе известного адъюванта (ИМД₅₀ 0,071 мл против 0,250 мл). Сорбированно-масляная вакцина на основе предлагаемого адъюванта активнее вакцины той же формы с известным адъювантом и более чем в 6 раз активнее сорбированной вакцины (ИМД₅₀ 0,051 против 0,066 и 0,320 соответственно). Одновременно отмечено, что у мышей на месте введения эмульсионной вакцины, приготовленной на основе предлагаемого адъюванта, местных реакций не установлено, а у остальных животных, в особенности при введении сорбированно-масляной вакцины с известным адъювантом, отмечены абсцессы.

В следующей серии опытов изучают иммуностимулирующую активность и реактогенность предлагаемого адъюванта, содержащего 9 ч. полимера II и I ч. Спан 80, в сравнительном аспекте с сапонином и известным адъювантом. В опытах используют концентрированные антигены вирусов, относящихся к разным таксономическим группам, в частности афтовирусам (вирус ящура типа 0), энтеровирусам (вирус ВБС) и калицивирусам (вирус ВЭС). Содержание вирусспецифического белка в различных препаратах устанавливают в пределах 40-60 мкл/мл. Содержание сапонина составляет 0,5 мг/мл. Основные опыты проводят на морских свинках массой около 500 г. При постановке опытов с некоторыми антигенами наряду с морскими свинками используют белых мышей массой 22 г или взрослых кроликов массой около 3 кг.

Объемы иммунизирующих препаратов для морских свинок равны 0,5 мл (в пересчете на вирусный антиген), для белых мышей 0,25 мл, а для кроликов 1 мл. Во всех случаях препараты вводят внутримышечно. Спустя 21 день животным вводят исходные препараты и через 10 дней после иммунизации от всех животных берут кровь для исследования на наличие вирусспецифических антител.

В качестве метода выявления антител используют реакцию вируснейтрализации (РН), а в отдельных случаях реакцию радиальной иммунодиффузии (РРИД). На протяжении всего опыта проводят клинические осмотры подопытных животных с оценкой общего состояния, местных воспалительных реакций и смертности. Результаты, полученные в опытах на морских свинках, суммированы в табл. 7, из которой видно, что предлагаемый адъювант по иммуностимулирующей активности значительно превосходит сапонин. Его превосходство над известным адъювантом было менее выраженным. Но особенно наглядно преимущество предлагаемого адъюванта над известным проявилось при оценке общего состояния животных, местной воспалительной реакции и смертности.

Средняя активность в РРИД сывороток, полученных от иммунизированных кроликов и белых мышей, как при ящуре, так и при ВВС и ВЭС, лежит в диапазоне 1:16-1:32 и 1:10-1:20 соответственно и не зависит от сравниваемых адъювантов.

В другой серии опытов иммуностимулирующую активность предлагаемого адъюванта, содержащего 9 ч. полимера I и 1 ч. Спан 80, оценивают в опытах на морских свинках и кроликах в сравнении с неполным адъювантом Фрейнда ("Дифко", США) и отечественным известным адъювантом. Исследования проводят на морских свинках массой 450-500 г и кроликах массой 2,5-3,0 кг.

В качестве иммунизирующих антигенов используют высококонцентрированный очищенный инактивированный препарат вирусов ящура, энтеровируса свиней 7 серотипа. Концентрация вирусспецифического белка колеблется от 20 до 100 мкг/мл. Животным 3-кратно вводят предварительно эмульгированные препараты. Цикл иммунизации проводят за 30-35 дней. Способ подготовки антигена и его происхождение не оказывают существенного влияния на качество целевого продукта. Установлено, что определяющим является количество вирусспецифического белка.

При получении антиводных сывороток для иммунизации используют препарат гамма-глобулина, полученный общепринятыми методами. Результаты сравнительного изучения адъювантной активности масляных препаратов представлены в табл. 8.

Представленные в табл. 8 данные свидетельствуют о том, что предлагаемый адъювант по своим иммуностимулирующим свойствам не уступает известному адъюванту и адъюванту Фрейнда. Во всех опытах отмечена значительно меньшая реактогенность предлагаемого адъюванта, так как на месте введения иммунизирующих препаратов на его основе обнаружены небольшие вакцинальные гранулемы с хорошей организацией ткани размером до 1х1х1 см у кроликов и 1х0,5х0,5 см у морских свинок. В то время как введение препаратов с известным адъювантом и адъювантом Фрейнда индуцировало образование абсцессов, а в некоторых случаях свищей.

П р и м е р 4. Для испытания на свиньях используют две серии эмульсионной противоящурной вакцины из лапинизированного вируса А₂₂соответственно на основе адъюванта с полимером II и известного адъюванта (серия 168) и три серии эмульсионной противоящурной вакцины из лапинизированного и концентрированного мембранной технологией вируса О₁соответственно на основе полимера I, полимера II и известного адъюванта.

Испытание проводят на подсвинках массой 30-35 кг, привитых эмульсионной вакциной внутримышечно в объеме по 1 мл и зараженных путем введения в слизистую оболочку языка гомологичного афтозного вируса в дозе 10000 ИЛ₅₀/0,2 мл.

При этом испытание проводят на 21-й день после введения вакцины. Результаты контроля иммуногенности образцов эмульсионной противоящурной вакцины из вируса типов А₂₂ и О₁ представлены в табл. 9.

Из представленных в табл. 9 результатов следует, что противоящурные эмульсионные вакцины, изготовленные на основе предлагаемого адъюванта, обладают более выраженной иммуногенной активностью по сравнению с вакциной на основе известного адъюванта, после применения которой и последующего контрольного заражения заболело ящуром одно животное (вакцина из вируса А₂₂) и два животных (вакцина из вируса О₁).

Кроме того, отмечено, что противоящурные вакцины с предлагаемым адъювантом обладают умеренной реактогенностью, так как на 30-й день после прививки у 50% животных изменений на месте введений не обнаружено, у остальных отмечены вакцинальные гранулемы размером до 4х3х2 см с хорошей организацией и проростом соединительной ткани, в то же время у подсвинков, привитых вакциной с известным адъювантом, обнаружены абсцессы.

П р и м е р 5. В опытах на крупном рогатом скоте используют по одной серии противоящурной эмульсионной вакцины из лапинизированного вируса А₂₂, изготовленных на основе предлагаемого и известного адъювантов. Результаты их контроля представлены в табл. 10.

Из приведенных в табл. 10 данных следует, что противоящурная эмульсионная вакцина из лапинизированного вируса ящура А₂₂, изготовленная на основе предлагаемого адъюванта, обладает выраженной иммуногенной активностью, так как при контрольном заражении через 21 день после вакцинации оба животных противостояли заболеванию, по сравнению с вакциной с известным адъювантом, где одно животное заболело ящуром с генерализацией процесса.

П р и м е р 6. Для испытания на овцах готовят одну серию эмульсионной вакцины из лапинизированного концентрированного вируса ящура А₂₂. Вакцину вводят подкожно в область внутренней поверхности бедра в дозе по 1 мл каждого разведения (в цельном виде и в разведениях 1:5 и 1:25). В качестве разбавителя используют "плацебо".

Заражение проводят через 21 день после прививки 10000 ИД₅₀ в слизистую оболочку языка адаптированного к организму овец гомологичного вируса. Результаты испытания вакцины с предлагаемым адъювантом представлены в табл. 11.

Из данных табл. 11 следует, что противоящурная вакцина из лапинизированного вируса А₂₂ показывает высокую иммуногенную активность, так как в прививном объеме содержится более 35 50%-ных иммунизирующих доз (ИМД₅₀<0,027 мл, прививной объем 1 мл). При патолого-анатомическом исследовании овец на 10-30 день после вакцинации на месте введения препарата абсцессов не обнаружено, только у 20% животных зарегистрированы вакцинальные гранулемы с проростом соединительной ткани размером 2х1х1 см.

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии. Целью изобретения является снижение вязкости и реактогенности адъюванта и повышение его стабильности и иммуностимулирующих свойств. Указанная цель достигается тем, что в препарате адъюванта в качестве масляной основы используют полимер общей формулы , где R = CH₃, R¹= C₆H₅, m= 0 20, n 1-15, a=0.3 или R = R¹= C₂H₅, m=0, n=3 12, a=0. Данный полимер смешивают с эмульгатором, выбранным из группы препаратов, стабилизирующих обратные эмульсии, при следующем соотношении компонентов, мас. полимер 85 95, эмульгатор 5 15. Полученный при этом препарат смешивают с вирусным антигеном, в результате чего получают стабильную, эффективную эмульсионную вакцину. 11 табл.

АДЪЮВАНТ, включающий масляную основу и эмульгатор, отличающийся тем, что, с целью снижения вязкости и реактогенности препарата и повышения его стабильности и иммуностимулирующих свойств, в качестве масляной основы он содержит полимер общей формулы

где R CH₃;
R′ C₆H₅;
m 0 20;
n 1 15;
a 0 3
или
R=R′=C₂H₅;
m 0;
n 3 12;
a 0,
при следующем соотношении компонентов, мас.

Полимер 85 95
Эмульгатор 5 15