СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ВАКЦИН Советский патент 1995 года по МПК A61K39/135 C12N7/00 

Изобретение относится к биологии, ветеринарии и может быть использовано в приготовлении вакцин.

Известен способ приготовления вакцин, включающий соединение водной фазы, содержащей вирусный антиген, с масляной фазой, содержащей минеральное масло, ланолин и эмульгаторы, и последующее эмульгирование.

Недостатком способа является низкая иммуногенность, технологическая трудоемкость, связанная с двукратным эмульгированием.

Целью изобретения является повышение иммуногенности ящурной вакцины.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве эмульгаторов используют смесь гипсофилина или сапонина с холестерином, взятых в количестве 5-7 и 0,5-1,0% соответственно от веса вакцины, причем гипсофилин или сапонин предварительно добавляют к инактивированному антигену, а холестерин вводят в масляную фазу, затем полученные смеси соединяют в равных объемах и эмульгируют.

Ускорение наступления иммунитета достигается за счет введения в состав компонентов эмульгированной вакцины наряду с минеральным маслом и ланолином эмульгаторов гипсофилина или сапонина и холестерина с выраженным адъювантным действием. Снижение вязкости происходит в результате образования множественной эмульсии, а снижение реактогенности за счет использования оптимальных количеств компонентов и введения в состав эмульсии не реактогенного масла (парфюмерного масла ГОСТ 4225-75).

П р и м е р 1. Для приготовления эмульгированной противоящурной из вируса А₂₂ вакцины были подготовлены три смеси ингредиентов, приведенные в табл. 1.

Наиболее предпочтительной является смесь, содержащая, мас. инактивированный антиген 44, гипсофилин или сапонин (20%-ный водный раствор) 6, парфюмерное масло 43,25, ланолин 6, холестерин 0,75.

Способ приготовления эмульгированной вакцины из лапинизированного вируса ящура типа А₂₂ сводится к приготовлению множественной эмульсии, состоящей из масляной и водной фаз, которые смешивают в равных пропорциях.

Масляную фазу с эмульгаторами готовят путем добавления 10-14% безводного ланолина и 0,5-1% холестерина к основе парфюмерного масла. Смесь стерилизуют автоклавированием при температуре 110-120^оС в течение 1 ч, а затем охлаждают до 20-30^оС.

Водную фазу готовят путем добавления 2% гипсофилина или сапонина к водному раствору антигена и тщательного их перемешивания.

Антиген готовят следующим образом. 10%-ную суспензию из лапинизированного вируса ящура готовят на растворе Хенкса или ацетатно-аммониевом буфере. При постоянном перемешивании в суспензию добавляют 10%-ный раствор полиэтиленимина до концентрации 0,2-0,5% Перемешивание суспензии продолжают до наступления флоккуляции белков. После образования флоккул приступают к экстрагированию связанного с растворенными белками полиэтиленимина путем последовательной обработки суспензии хлороформ и полиакриловой кислотой. При эффективном перемешивании в суспензию добавляют 5 об. хлороформа, который эмульгируют в суспензии с помощью коллоидных мельниц или гомогенизаторов.

Суспензию с хлороформом перемешивают до ее обесцвечивания. В обесцвеченную суспензию добавляют 0,006% полиакриловой кислоты, которая образует с полиэтиленимином нерастворимую поли-соль, удаляя из суспензии оставшуюся часть растворенного комплекса полиэтиленимин белок. Суспензию, очищенную полиэтиленимином, хлороформом и полиакриловой кислотой, сепарируют до прозрачности не менее 90% при проверке 20 мм слоя суспензии на ФЭК-М против дистиллированной воды при красном светофильтре.

Затем суспензию фильтруют через стерилизующие пластины СФ, ГОСТ 480-41, диаметром 300 мм, используя многорамные фильтровальные аппараты из расчета одна пластина на 30-50 л антигена. Фильтрование ведут при давлении 0,5 атм в течение 6 ч. В очищенную и фильтрованную суспензию при постоянном помешивании добавляют 4%-ный раствор формальдегида в количестве 1% от объема суспензии, устанавливают рН в пределах 8,2-8,6 с помощью гликоколового буфера или 5 М раствора аммиака и проводят инактивацию вируса при температуре 25-26^оС в течение 48 ч с периодическим перемешиванием (один раз в час в течение 5 мин). После инактивации рН суспензии устанавливают в пределах 7,6-7,8 путем добавления 5% -ного раствора соляной кислоты или 5 М раствора уксусной кислоты и охлаждают до 4-6^оС. После проверки авирулентности на мышатах-сосунах антиген концентрируют полиэтиленгликолем (ПЭГ) с мол.в. 6000. С этой целью к антигену добавляют 10% ПЭГ и NaCl до конечной концентрации 0,5 М.

Раствор перемешивают до полного растворения добавленных компонентов и оставляют на 2 сут. Температура раствора в течение 2 сут должна быть 4^оС. По истечении указанного времени осадок отделяют центрифугированием при 2-3 тыс. об/мин в течение 20-30 мин. Полученный осадок растворяют в растворе Хенкса или ацетатно-аммониевом буфере, 1/10 объема от объема исходной суспензии. К полученному антигену добавляют 2% гипсофилина или сапонина в виде 20%-ного раствора на ацетатно-аммониевом буфере или растворе Хенкса и получают водную фазу. Предварительно гипсофилин или сапонин стерилизуют автоклавированием при 105-110^оС в течение 1 ч и значение рН полученного раствора доводят до 7,6.

Приготовление эмульгированной вакцины ведут путем диспергирования водной фазы в масляной, т.е. путем диспергирования концентрированной суспензии инактивированного вируса с гипсофилином или сапонином и парфюмерного масла в присутствии эмульгаторов холестерина и безводного ланолина. Для этого равные объемы (с колебанием не больше 5%) суспензии инактивированного вируса с 2% гипсофилина или сапонина и парфюмерного масла с холестерином (1%) и безводным ланолином (10%) смешивают на коллоидных мельницах типа IV-8 или IV-10.

В результате получают эмульгированную вакцину, которая представляет собой молокоподобную жидкость, легко растворимую у воде. При длительном хранении вакцины происходит незначительное отделение водной фазы (5%), но при встряхивании препарат вновь превращается в однородную молокоподобную жидкость. Вакцина имеет жидкую консистенцию (10-30 сСт), легко рассасывается с места введения, не вызывает образования абсцессов и обладает выраженной иммуногенной активностью для лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Иммуногенная активность противоящурной эмульгированной вакцины для мышей и морских свинок приведена в табл. 2.

Из данных табл. 2 видно, что 50%-ная иммунизирующая доза противоящурной эмульгированной вакцины и лапинизированного вируса А₂₂ для мышей была равна 0,0125 мл, для морских свинок 0,034 мл.

Внутримышечная вакцинация подсвинков эмульгированной противоящурной вакциной в дозе 0,5 и 1,0 мл сопровождалась появлением в сыворотке крови вируснейтрализующих антител с титром: на 20 день 4,0-6,5 лог₂ и на 30 день 3,23-6,5 лог₂.

При контрольном заражении вакцинированных животных вирусом ящура, адаптированным к организму свиней, путем введения 10000 мышиных ЛД_50/0,2мл в две точки слизистой языка установлена полная устойчивость к генерализованной форме ящура.

Контрольные (невакцинированные) животные заболели генерализованной формой ящура через 72 ч.

При патолого-анатомическом осмотре убитых животных в месте введения вакцины обнаружены едва заметные соединительно-тканевые вакциальные узелки.

П р и м е р 2. На основе множественной эмульсии, полученной как описано в примере 1, была приготовлена инактивированная культуральная вакцина против вируса ВБСт.

В составе 100 л вакцины входят, мас.

Суспензия инактиви- рованного вируса 45-43
Гипсофилин или са-
понин (20%-ный вод- ный раствор) 5-7 Парфюмерное масло 42-44,5 Безводный ланолин 5-7 Холестерин 0,5-1
Эмульгированную вакцину против ВБСт готовят по следующей технологии. В качестве антигена используют штамм вируса везикулярной болезни свиней Т-75, адаптированный к монослойной культуре клеток IB-RS-2 с титром инфекционности и не ниже 10^7,0 ТЦД_50/мл и прошедший не более 10 пассажей в данной клеточной системе.

Результаты изучения иммуногенной активности противоящурной эмульгированной вакцины на свиньях приведены в табл. 3.

Полученный вирус предварительно очищают от суспензии клеток центрифугированием при 2500 об/мин в течение 20 мин. Затем в вирусную суспензию добавляют 10% -ный раствор гексаметафосфата натрия на дистиллированной воде из расчета 10 мл раствора на 1 л обрабатываемой жидкости. Вируссодержащую суспензию тщательно перемешивают и устанавливают рН 4,0-4,2 с помощью 1 н. раствора HCl. После получасового контакта при комнатной температуре помутневшую суспензию центрифугируют в течение 30 мин при 2500 об/мин. Полученный осадок ресуспендируют в солевом растворе Хенкса (рН 8,0), уменьшая объем в 10 раз по сравнению с исходным. К гомогенату добавляют 20% хлороформа, шуттелируют 10 мин и центрифугируют в течение 15 мин при 2500 об/мин. рН центрифугата устанавливают в пределах 7,6-7,8 путем добавления гликоколового буфера с рН 9,9. Затем таким же образом проводят вторичное осаждение полученного вируса гексаметафосфатом натрия. Полученный осадок ресуспендируют в растворе Хенкса рН 8,6, уменьшая объем еще в 10 раз. Таким образом получают материал, концентрированный в 100 раз по сравнению с исходным.

Аналогично вирус можно концентрировать полиэтиленгликолем (ПЭГ). Для этого в вируссодержащую суспензию добавляют 0,14 М NaCl и ПЭГ-6000 (до конечной концентрации 7% ), тщательно перемешивают и оставляют при 4^оС на 18 ч. После этого центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. Осадок ресуспендируют в растворе Хенкса (рН 8,0), трижды отмывая его методом центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 мин и уменьшая конечный объем в 100 раз по сравнению с исходным. Надосадки после каждого отмывания смешивают вместе и очищают хлороформом в 10%-ной концентрации.

До инактивации материал хранят при 4^оС и консервируют 0,02% азида натрия. Вирус инактивируют путем добавления в вируссодержащую суспензию 0,05% аминоэтилэтиленимина, значение рН суспензии доводят гликоколовым буфером до 8,4. После чего помещают на инактивацию в термостат с температурой 26±0,5^оС на 40 ч. В процессе инактивации вирусную суспензию периодически тщательно перемешивают. После окончания срока инактивации значение рН суспензии доводят 1 н. раствором HCl до 7,2-7,4. Затем составляют вакцину, технология приготовления которой сводится к приготовлению множественной эмульсии, состоящей из масляной и водной фаз, которые смешивают в равных пропорциях.

Масляную фазу готовят следующим образом. В подогретое до 80^оС парфюмерное масло (ГОСТ 4225-75) вносят 10% по объему расплавленного при 80^оС безводного ланолина и 1,5 г холестерина, после чего смесь тщательно перемешивают встряхиванием до полного растворения ланолина и холестерина. Затем масло автоклавируют при 120^оС в течение 1,5 ч.

Водную фазу готовят следующим образом. Исходный инактивированный антиген с выявленным содержанием вирусного белка (150 S компонента) разводят раствором Хенкса с таким расчетом, чтобы в 1 мл антигена содержалось 7,2 мкг 150 S компонента. Расчет ведут по формуле
X где Х необходимое количество исходной инактивированной суспензии вируса, мл;
V необходимый для составления вакцины объем антигена, мл;
6 доза 150 S компонента вируса ВБС, необходимая для составления вакцины, мкг/мл;
N количество 150 S компонента вируса ВБС в исходной инактивированной суспензии вируса ВБС мкг/мл.

В стерильной дистиллированной воде растворяют гипсофилин или сапонин, после чего значение рН полученного раствора доводят до 7,6. Затем раствор стерилизуют автоклавированием при 120^оС в течение 1,5 ч.

После разведения антигена до необходимой концентрации 150 S компонента к антигену добавляют 20% раствора гипсофилина или сапонина, таким образом получая водную фазу.

Приготовление вакцины ведут путем диспергирования водной фазы в масляной. Для этого равные объемы (с колебанием не больше 5%) антигена с гипсофилином или сапонином и парфюмерного масла с холестерином и безводным ланолином смешивают на коллоидных мельницах типа IV-8 или IV-10.

В результате получают эмульгированную вакцину против вирусов ВБС, которая представляет собой молокоподобную жидкость, легко растворимую в воде. При длительном хранении вакцины происходит незначительное отслоение водной фазы (5%), но при встряхивании препарат вновь превращается в однородную молокоподобную жидкость. Вакцина имеет жидкую консистенцию (10-30 сСт), легко рассасывается с места введения, не вызывает образования абсцессов и обладает выраженной иммуногенной активностью для свиней в дозе 0,5 мл.

Образцы вакцин, полученные указанным способом, испытывали на свиньях весом 25-30 кг. Свиней разбили на три аналогичные группы по 4 животных в каждой. Животных всех групп иммунизировали внутримышечно в дозе 0,5 мл. Первую группу животных заражали через 3 дня после вакцинации, вторую через 7 дней и третью через 14 дней. Результаты опыта приведены в табл. 4.

Из данных, приведенных в табл. 4, видно, что животные первой и второй групп были полностью устойчивы к заражению гомологичным вирусом в дозе 10⁴ ИД₅₀. Из 4 животных третьей группы генерализованной форме болезни ВБС противостояло 3 животных при 100%-ном заболевании в контрольной группе. Таким образом, инактивированная культуральная вакцина против ВБС на основе сложной эмульсии является эффективным и высокоиммуногенным препаратом и может с успехом использоваться для профилактики ВБС.

Споcоб приготовления противоящурной вакцины позволяет получать выcокоэффективную иммуногенную вакцину, cнизить трудоемкоcть ее получения.

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ВАКЦИН, включающий соединение водной фазы, содержащей вирусный антиген, с масляной фазой, содержащей минеральное масло, ланолин и эмульгаторы, и последующее эмульгирование смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения иммуногенности, в качестве эмульгаторов используют смесь гипсофилина или сапонина с холестерином, взятых в количестве 5-7 и 0,5-1,0% соответственно от массы вакцины, причем гипсофилин или сапонин предварительно добавляют к инактивированному антигену, а холестерин вводят в масляную фазу, затем полученные смеси соединяют в равных объемах и эмульгируют.