Способ приготовления противопастереллезной вакцины Советский патент 1993 года по МПК A61K39/102 A61K39/39 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано в научно-исследовательской работе и биологической промышленности при разработке и производстве средств специфической профилактики пастереллеза сельскохозяйственных животных.

Известно, что физические (вязкость, температура застывания, стабильность) и биологические (иммуногенная активность, реактогенность) свойства вакцин во многом зависят от их формы и состава. В ветеринарной практике обычно используют сорбированные и эмульсионные вакцины.

Известен способ приготовления сорбированной противопастереллезной вакцины, включающий осаждение смеси культур пас- терелл восьмисуточного и двухсуточного роста 10%-ным раствором алюминиевых квасцов и инактивацию 0,16-0,18%-ным формалином в течение 6 сут. {1}.

Недостатком вакцины, приготовленной в соответствии с данным способом, является непродолжительность иммунитета у вак- цинированных сельскохозяйственных животных, при этом прививки производятся двукратно в относительно высоких дозах, особенно для телят: 50 мл - первая прививка. 10 мл - вторая.

Указанный недостаток устранен в известном способе приготовления эмульсионной противопастереллезной вакцины, включающем смешивание в равном соотношении концентрата инактивированного бактериального антигена с адыовантом, содержащим в качестве масляной основы минеральное масло и в качестве эмульгатора ланолин при соотношении 83:17, и последующее эмульгирование полученной смеси 2.

В качестве масляной основы обычно использовали следующие минеральные масла:

масло вазелиновое медицинское, ГОСТ 3164-52;

масло парфюмерное, ГОСТ 4225-75;

вакцинное масло (Ярославский нефте- маслозавод им. Д. И. Менделеева).

Данный способ взят в качестве прототипа как наиболее близкий к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату при использовании.

Недостатки способа-прототипа состоят в том, что в настоящее время вакцинное масло не производится в промышленных масштабах, а вакцины, изготовленные на вазелиновом или парфюмерных маслах, обладают повышенной вязкостью, что существенно затрудняет процесс массовой

0

5

0

5

9

вакцинации сельскохозяйственных животных против пастереллеза.

Кроме того, препараты, полученные способом-прототипом, обладают сравнительно невысокой иммуногенной активностью.

Целью изобретения является повышение иммуногенной активности, снижение вязкости и реактогенности препарата.

Это достигается тем, что в известном способе приготовления противопастереллезной вакцины, включающем операции смешивания в равном соотношении инактивированного бактериального антигена с адъювантом, содержащим масляную основу и эмульгатор в соотношении 83:17, и последующего эмульгирования полученной смеси, в соответствии с изобретением в качестве масляной основы используют по- лиэтилсилоксановую жидкость.

В качестве эмульгаторов можно использовать эмульгаторы второго рода - сорбита- ноолеат (Спан-80), пентазритритоолеат, эмульгатор ВНИИЖ, ланолин и др., образующие обратные эмульсии.

Полиэтилсилоксановую жидкость готовят в соответствии с требованиями 3.

Полэтилсилоксановая жидкость представляет собой полимер линейной структуры общей формулы

(Г2Н5

5

-0-SbC2H5

П

I

с,н

гп5

()

Поэтилсилоксановая жидкость бесцветна и прозрачна, химически инертна, взрыво0 безопасна, нетоксична не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки. Она растворима в ароматических и хлорированных углеводородах, не растворима в низших спиртах и воде.

5 Отличительной особенностью по ли- , этилсилоксановой жидкости является ее хо- рошая совместимость с минеральными маслами. Жидкость застывает при температуре ниже -60°С и сохраняет свойства при

0 температуре 150°С. Она не содержит механических примесей, имеет концентрацию водородных ионов (рН) водной вытяжки 6-7. Для изобретения наиболее целесообразной является полиэтилсилоксановая жидкость

5 марки ПЭС-3. Жидкость марки ПЭС-3 характеризуется вязкостью при 20°С 14-17 сСт, плотностью при 20°С 0,95-0,97 г/см3.

Известно использование полиэтилси- локсановой жидкости в приборо- и станкостроении в качестве антифризных присадок

минеральным маслам и в легкой промыш- енности в качестве пластификаторов 4.

По результатам опытов на лаборатор- ых и сельскохозяйственных животных об- аружены новые свойства полиэтилсил- ксановой жидкости: не разрушать белко- ые антигены, способность выступать в ка- естве дисперсной среды в эмульсиях, бладэть низкой реактогенностью и повыать иммуногенную активность противопа- тереллезной вакцины.

При изучении физических свойств мульсий на основе полиэтилсилоксановой идкости (стабильность, вязкость) с различении эмульгаторами установлено, что из из- естных и получаемых в СССР эмульгаторов аиболее подходящими являются ланолин и орбитаноолеат 5.

Таким образом, введение в состав про- ивопастереллезной вакцины полиэтилси- оксановой жидкости в качестве масляной сновы придает иммунизирующему препа- ату новые свойства.

П р и м е р 1. Метровые расплодки вак- инных штаммов Pasteurella Multacida вы- ащивают в реакторе в течение 15 ч при емпературе 36-37°С с постоянным перемеиванием и подачей стерильного воздуха. о окончании выращивания определяют рН концентрацию выращенных пастерелл, /1икроскопируют и делают высевы на МПА, АПБ и МППБ для последующего подтверж- ения чистоты роста. Накопление микро- ных клеток в 15-часоеой культуре обычно оответствует 19 млрд/мл. Выращенную ультуру охлаждают до 15°С и концентриру1 т центрифугированием. Концентрат раз- одят до 20 млрд/мл микробных тел на /15 М фосфатно-буферном растворе и нэктивируют формалином в течение 24 ч ри 37°С.

По окончании инактивации суспензию хлаждают до 20°С. После проверки сте- ильности и безвредности инактивирован- ую бактериальную суспензию используют ля изготовления эмульсионной вакцины. ля этого инактивированный бактериэль- ый антиген с содержанием 20 млрд/мл икробных тел смешивают путем механиче- кого диспергирования в равном соотноше- ии с масляным адъювантом, содержащим олиэтилсилоксановую жидкость в качестве асляной основы и эмульгатор безводный анолин в соотношении 83:17. Для приго- эвления адъюванта ланолин предварительно асплавляют в автоклаве или сухожаровом 1кафу при 90°С, Затем смесь полиэтилси- ;эксановой жидкости и ланолина загружают реактор с мешалкой. Смесь стерилизуют 3 мин при 110°С, после чего ее быстро

охлаждают до 15°С. Затем осуществляют предварительное смешивание. Для этого к полученному адьюванту по стерильному трубопроводу перекачивают необходимое 5 количество бактериального антигена и включают механическую мешалку на 1 ч со скоростью 150 об/мин. В последующем мешалка включается каждые 60 мин на 10 мин. Продол жительность предварительного

10 смешивания бактериального антигена с адъювантом в реакторе 15 ч при температуре 15°С.

Затем дальнейшее эмульгирование вакцины ведут на коллоидной мельнице JV ID- 5 75 PS, позволяющей вести поточное приготовление серии вакцины и обеспечивающей ее стерильность. Вакцинная эмульсия из коллоидной мельницы через спусковую трубу поступает непосредствен0 но-на расфасовку.

Полученная вакцина является стойкой эмульсией белого цвета или с желтым оттенком, вязкой консистенции, рН 7,2-7,6. При длительном хранении допускается отслое5 ние масляной основы на 0,5-1,0 см, которое устраняется тщательным энергичным встряхиванием флакона с вакциной. Срок годности вакцины 12 месяцев со дня изготовления.

0 Вязкость вакцины определяли с помощью капиллярного вискозиметра ВПЖ-4 с диаметром капилляра 1,47 мм по ГОСТ 33-36 при температуре 200С. Кинематическую вязкость выражали в мм /с,

5 Текучесть вакцин оценивали путем визуального наблюдения при допустимой температуре хранения 1-10°С.

П р и м е р 2. Иммуногенную активность противопастереллезных вакцин определя0 ли путем качественной оценки в опытах на взрослых кроликах массой.2,5-3 кг. Препараты вводили внутримышечно однократно пяти кроликам в дозе 1,5мл в области бедра. Через 30 дней после вакцинации всем при5 витым и трем контрольным животным вводили заранее подтитровэнную смертельную дозу вирулентного штамма пастерелл. Иммуногенную активность оценивали путем установления процента защиты.

0Безвредность вакцины определяли на взрослых кроликах массой 1,5-2 кг и на белых мышах массой 18-20 г. На каждый препарат использовали 2 кролика и 5 белых мышей. Вакцину вводили внутримышечно в

5 дозе З мл (по 1,5 мл е области каждого бедра; мышам подкожно в области спины по 0,3 мл).

Безвредность оценивали по клиническому состоянию животных и по выживаемости. Безвредной считали вакцину, если

все животные оставались живыми и выглядели клинические здоровыми в течение 10 дней после введения препаратов.

П р и м е р 3. Физические и биологические свойства предлагаемого состава вакцины оценивали при сравнении с прототипом. В табл. 1 и 2 приведены результаты испытаний противопастереллезной эмульсионной вакцины разных составов.

Как видно из табл. 1, вязкость эмульси- онной вакцины предлагаемого состава почти в 2 раза меньше, чем у вакцины с известным составом. Кроме того, предлагаемая вакцина в отличие от вакцины, полученной способом-прототипом, обладает текучестью при 1-10°С, что не потребует ее предварительного подогрева перед применением.

Из табл. 2 следует, что вакцина предлагаемого состава безвредна и создает более

напряженный иммунитет, чем вакцина известного состава.

Таким образом, предложенный адъю- вант для противопастереллезной вакцины повышает иммуногенность вакцины, обладает слабой реактогенностью и низкой вязкостью, что позволяет использовать его в промышленном производстве вакцины.

(56) 1. Авторское свидетельство СССР № 94044, кл. А 61 К 39/00.1951.

2. ТУ 46-771-72.

3. ГОСТ 13004-77.

4. Каталог Кремнийоргзнические продукты, выпускаемые в СССР, М.: Химия, 1975.

5. Абрамзон А. А. и др. Поверхностно-активные вещества. Справочник. М.: Химия, 1979, с. 376.

Таблица 1

Влияние состава масляного адью ванта на вязкость эмульсионной противопастереллезной

вакцины

Примечание: соотношение антигена и масляного адьюванта 1 : 1

Влияние состава противопастереллезной вакцины на ее иммуногенную активность и безвредность

Таблицэ2

Формула изобретенийсоотношении 83 : 17. и последующее

эмульгирование полученной смеси, отличаСПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОТИ-ющийся тем, что, с целью повышения им- 1ЮПАСТЕРЕЛЛЕЗНОЙ ВАКЦИНЫ, вклю- 5 мУногенной активности, снижения ающий смешивание в равном вязкости и реактогенности препарата, в соотношении инактивированного бактери- качестве масляной основы используют по- (льного антигена с адъювантом, содержа- лиэтилсилоксановую жидкость. идим масляную основу и эмульгатор в