Способ получения носителя для иммунодиагностики Советский патент 1991 года по МПК G01N33/543 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения окра- шенных полиакролеиновых латексов, которые могут быть использованы в качестве носителей для создания иммунодиспер- сиснных диагностикумов.

Цель изобретения - повышение устойчивости суспензии носителя и уменьшение расхода иммуноглобулинов.

Пример1. 8 термостатированную колбу, снабженную механической мешалкой и вводом для инертного газа, помещают 3 мл свежеперегнанного акролеина, 70 мл дистиллированной воды с растворенными в ней 0,025 г пиронюна (0,33 мас.%) и постепенно добавляют 3 мл 0,2 н. КОН до рН 8,0. Смесь перемешивают в течение 2,5 ч при комнатной температуре затем температуру повышают до 60°С, продувают слабым током аргона в течение 20 мин, добавляют

0,12 г персульфата калия (5%) и выдерживают при 50°С в течение 3 ч. Получают окрашенную в ярко-розовый цвет суспензию полиакролеина со средним диаметром частиц 1,5 мкм и коэффициентом полидисперсности К 1,08. Полученную суспензию трижды промывают дистиллированной водой и отделяют от непрореагировавших реагентов центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин. Отмытый осадок редиспергируют в дистиллированной водедо5%-ной концентрации. 4 мл полученной суспензии осаждают центрифугированием. Осадок суспендируют в 4 мл 0,15М фосфатно-солевого буфера (ФСБ), рН 6,5, добавляют равный объем 2,5%-ного водного раствора желатина и выдерживают при комнатной температуре в течение 18 ч. Полученную суспензию носителя трижды промывают дистиллированной водой для

о к:

с

43

со

о

удаления несвязавшегося желатина на центрифуге и лиофильно высушивают.

П р и м е р 2. В колбу, снабженную механической мешалкой, вводом ддя инертного газа и помещенную в термостат, наливают 2,6 мл свежеперегнанного акролеина, 70 мл дистиллированной воды с растворенными в ней 0,0008 г пиронина (0,001%) и постенпенно добавляют б мл 0,2 н.КОН до рН 12. Перемешивают 4 ч при 20°С, затем температуру смеси повышают до 60°С, продувают аргоном в течение 20 мин, добавляют 0,05 г (2%) персульфата калия и перемешивают в течение 3 ч при 60°С. Получают окрашенную в розовый цвет суспензию полиакролеиновых частиц со средним диаметром-0,4 мкм и К 1,05. отмытой игюлученной аналогично примеру 1 5%-ной полиакролеиновой суспензии осаждают центрифугированием, осадок суспендируют в 0,2 М ФСБ, рН 6,5, добавляют равный объем 5%-ного водного раствора желатина и выдерживают при комнатной температуре в течение 12 ч. Далее обработку проводят аналогично примеру 1.

Пример 3. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, в реакцию берут следующие количества компонентов: акролеина 5 мл; пиронина 0,9 г (0,1 %); дистиллированной воды 68 мл; 0,2 н.КОН 6 мл; персульфата калия 0,2 г. Получают полиак- ролеиновую суспензию ярко-розового цвета со средним диаметром частиц 1,8 мкм и К 1,06. Далее 4 мл отмытой 5%-ной суспензии осаждают центрифугированием. Осадок суспендируют в 4 мл 0,1 М карбонатного буфера, рН 7,6, добавляют 2 мл 3%-ного водного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА). Полученную смесь выдерживают при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 10ч. Далее процесс ведут аналогично примеру 1. Пример 4. Втермостатировануюколбу помещают 3 мл акролеина, 70 мл дистиллированной воды с растворенными в ней 0,3 г (0,0035 мас,%) красителя малахитового зеленого и постепенно добавляютбмл 0,2 н.КОН до рН 11. Перемешивают 3 ч при 30°С, затем температуру смеси повышают до 70°С, продувают агроном в течение 20 мин и добавляют 0,075 гдинитрутаазобксизомасляной кислоты в 1,5 мл эталона (3%) м перемешивают при этой температуре 2,5 ч. Получают окрашенную в зеленый цвет полиакролеи- новую суспензию со средним диаметром ча- стиц 1.2 мкм и К 1,08. Отмытый центрифугированием осадок, полученный из 4 мл 5%-ной суспензии аналогично описанному в примере 1, суспендируют в 4 мл 0,1 М карбонатного буфера, рН 7,4, и добавляют к нему 4 мл 1 %-ного раствора овальбу- мина. Смесь выдерживают при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 14 ч. Далее процесс ведут аналогично примеру 1.

Пример 5. В термостатированную колбу помещают 3 мл акролеина, 70 мл дистиллированной воды, содержащей 0,006 г красителя (0,007 мас.%) генциана фиолетового, и добавляют 6 мл 0,2 н.КОН. Перемешивают 2,5 ч при 35°С, затем температуру смеси повышают до 85°С, процувают аргоном 20 мин и добавляют 0,10 г пероксида бензоина (4%) в 2,5 мл этанола и продолжают

перемешивание при 85°С в течение 2 ч. Получают окрашенную в синий цвет полизкро- леиновую суспензию со средним диаметром частиц 1,45 мкм и К 1,07.4 мл про иытой 5%-ной суспензии осаждают центрифугированием. Осадок суспендируют в 5 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,2, и добавляют 5 мл 1,5%-ного водного раствора казеина. Смесь выдерживают при комнатной температуре и перемешивании в течение 12 ч. Далее процесс ведут аналогично примеру 1.

Пример 6. Получение сенсибилизированного носителя.

а)Активирование носителя.

50 мг носителя, полученного по примеру 1, суспендируют в 1 мл дистиллированной воды, добавляют равный объем 0,1 %-ного водного раствора танина, выдерживают 30 мин при 40°С и двукратно отмывают дистиллированной водой.

б)Сенсибилизация.

Активированный носитель суспендируют в 1 мл 0,15 М ФСБ, рН 6,5, до 5%-ной концентрации. К полученной суспензии добавляют 4 мл физиологического раствора поваренной соли (ФР), рН 7,2, содержащего 0,25 мг у -глобулинов человека, Смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре, периодически встряхивая. Сенсибилизированную суспензию носителя центрифугируют, дважды промывают 0,1М ФСБ, рН 7,2, суспендируют в 20 мл ФР, рН 7,2. и применяют доя постановки реакции суспензионной агломерации (РСА).

Примеры 7-10.

а) Активирование носителей. По 50 г носителя, полученных по примерам 2-5, суспендируют в 1 мл 0,2 М карбо5 натного буфера, рН 8,5, добавляют равный объем 0,1 %-ного водного раствора эпихлор- гидрына. Смесь выдерживают при 37°С в . течение 30 мин, дважды промывают дистиллированной водой и суспендируют в 1 мл 0,1 М карбонатного буфера, рН 8,5.

б) Сенсибилизация.

К полученном суспензии добавля ют 4 мл Ф Р, рН 7,4, содержащего 0,3 мг у -глобулина человека, выдерживают 1,5 ч при 37°С при постоянном перемешивании. Сенсибилизированную суспензию центрифугируют и промывают аналогично описанному s примере б.

Пример 11. Постановка РСА,

РСА проводят для определения ревматоидного фактора Rf аналогично реакции непрямой гэмагглюгизации в микропланшетах с U-образными лунками. Для эгого в лунках микропланшета готовят ряд последовательных двукратных разведений (по 0,05 мл) Rf-пояожительной и нормальной (контрольной) человеческой сывороток. Затем в каждую лунку вносят по одной капле 0,2%-ной суспензии сенсибилизированного носителя, полученного согласно примеру 6. Планшет встряхивают и оставляют в покое при комнатной температуре. Результаты РСА учитывают через 1,5-2 ч. При положительной реакции суспензия сенсибилизиро- ванного носителя после оседания равномерно покрывает дно лунки в виде агглютината нежно-розового цвета. При отрицательной реакции суспензия оседает на дно лунки в виде колечка или компактной пуговки ярко-розового цвета с четко очерченными краями. Результаты анализа представлены в. таблице.

Результаты сравнительного анализа в РСА Rf-позитиЕНОй сыворотки и нормальной (контрольной) сыворотки человека с по- мощью сенсибилизированных у-глобулинами человека носителей, полученных по предлагаемому и известному способам, представлены в таблице.

Как видно из таблицы, сенсибилизированный носитель, полученный по известному способу, дает ложно-положительную реакцию в малых разведениях нормальной (отрицательной) сыворотки, Это свидетельствует о неустойчивости суспензии носителя Е сыворотках при разведения последних в 2-16 раз. В то же время полученный сенсибилизированный носитель стабилен в малых разведениях сыворотки.

П р и м е р 12. Получение носителя, сенсибилизированного белковым антигеном.

Активирование носителя, полученного 5 по примзру 2, проводят аналогично примеру 7. К активированной суспензии носителя добавляют 4 мл ФР, рН 7,4, содержащего 0,25 мг сывороточного альбумина человека, выдерживают 2 ч при 37СС при постоянном 10 перемешивании. Далее процесс ведут аналогично примеру 6. Постановку РСА осуществляют с гипериммунными сыворотками кроликов, иммунизированных сывороточным альбумином человека. Значения титров

5 1:128 тыс. - 1:512 тыс, С нормальными кроличьими сыворотками начиная с разведения 1:10 наблюдалась отрицательная реакция.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать носитель, для сенсиби0 лизации которого требуется в 30-40 раз меньшее количество у -глобулина по сравнению с - вастным способом, что повышает экэноми юность и удешевляет анализ. Кроме того, полученный по предлагаемому спосо5 бу носитель после сенсибилизации может быть использован для анализа сывороток в малых разведениях их, что приводит к повышению надежности и снижению трудоемкости анализа,

0 Формула изобретения а 1. Способ получения носителя для иммунодиагностики, предусматривающий полимеризацию акролеина в водно-щелочной среде с образованием сферических микро5 частиц, отличающийся тем, что, с целью повышения устойчивости суспензии носителя и уменьшения расхода иммуноглобулинов, полимеризацию акролеина в водно-щелочной среде проводят при рН 80 12 в присутствии 0,001-0,1 мас.% водорастворимого красителя, полученные окрашенные сферические частицы подвергают радикальной полимеризации в присутствии 2-5% от массы акролеина

5 пероксидных радикальных инициаторов, а затем модифицируют белками в соотношении 1: (0,3-1,0) в течение 10-18 ч.

2, Способ по п. 1,отличающейся тем, что в качестве белков для модификации

0 используют желатин, альбумин, казеин.

Примечание. положительная реакция; ± слабоположительная реакция; - - отрицательная реакция.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения носителя для иммунодисперсионных диагностикумов. Целью изобретения является повышение устойчивости суспензии носителя и уменьшение расхода иммуноглобулинов. Для этого проводят полимеризацию акролеина в водно-щелочной среде при оН 8-;2 в присутствии 0,001-0,1 мас.% водорастворимого красителя. Полученные окрашенные полиакролеинсвые частицы подвергают радикальной полимеризации в присутствии 2-5% от массы акролеина пе- роксидных радикальных инициаторов, затем обрабатывают белками при соотношении 1: