СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА СУСПЕНЗИОННОГО ЧУМНОГО АНТИГЕННОГО НА ОСНОВЕ ФРАКЦИИ I Российский патент 2003 года по МПК G01N33/531 G01N33/569 A61K39/02 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в получении высокочувствительных и стабильных диагностикумов.

Иммунологические свойства диагностикума во многом зависят от выбора носителя, на котором иммобилизованы антигены или антитела.

Известно, что наиболее приемлемым носителем являются полиакролеиновые (ПА) частицы. Диагностикумы, изготовленные на их основе, имеют больше преимущества перед эритроцитарными, полистироловыми и др. по специфичности и чувствительности. [Пат. РФ 2012888, G 01 N 33/537, от 15.05.94. Бюл. 9; Пат. РФ 2092852, G 01 N 33/53, от 10.10.97. Бюл. 28].

Наиболее близким к заявляемому является способ получения антигенного диагностикума с использованием в качестве носителя окрашенных полиакролеиновых частиц [Зайцев А.А. К вопросу об аффинности моноклональных антител к фракции 1 чумного микроба /Ставрополь, 1992.-14 с.- Библиогр.: 18 назв. - Деп. в ВИНИТИ 17.06.92, 2001-В92 //Депонированные науч. работы: (Естеств. и точные науки, техника). - М., 1992. - 10 (252). - С.15-166]. Способ осуществляется следующим образом. В фосфатно-буферную суспензию с рН 7,0-7,4 полиакролеиновых частиц с диаметром 0,3-2,0 мкм добавляют суспензию фракции I чумного микроба при соотношении 0,1-0,3 мг антигена на 100 г носителя. Смесь выдерживают 3 ч с периодическим перемешиванием, осаждают и дважды промывают осадок физиологическим раствором. Полученный диагностикум диспергируют в защитной среде и лиофильно высушивают.

Недостатком прототипа является низкая стабильность жидкого диагностикума, приводящая к потере чувствительности при использовании в реакции непрямой суспензионной агглютинации (РНСА) в 4-8 и более раз в течение 14-30 суток.

Технический результат изобретения заключается в повышении чувствительности и срока сохранения активности диагностикума.

Указанный технический результат достигается тем, что способ включает сенсибилизацию суспензии окрашенных полиакролеиновых частиц антигеном чумного микроба, перемешивание смеси в течение 3 ч, осаждение и отмывку диагностикума, отличающийся тем, что сенсибилизацию проводят антигеном фракции 1 чумного микроба при соотношении 0,1-0,3 мг антигена на 100 мг полиакролеиновых частиц в 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,0-7,4 и смесь дополнительно подвергают нагреванию до 70-80^oС, перемешивают в течение 30-40 мин и отделяют несвязавшийся с частицами антиген фракции 1 отмывкой 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН 7,0-7,4.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Дополнительная термическая обработка суспензии носителя и антигена при 70-80^oС в течение 30-40 мин приводит к разрушению нестабильных биополимеров фракции I. Отколовшиеся от фиксированных на носителе молекул фракции I фрагменты антигена являются иммунологически активными и вступают в конкуренцию с самим диагностикумом за связывание с антителами, что приводит к снижению чувствительности данного диагностикума в РНСА. Чтобы избежать этого негативного явления, отколовшиеся фрагменты антигена либо ковалентно связывают с носителем, либо удаляют путем центрифугирования.

Без предварительной термической обработки на носителе находится много нестабильных биополимеров фракции I. Поэтому в таком диагностикуме процесс накопления иммунологически активных биополимеров, не связанных с носителем, идет быстро, что соответственно ведет и к снижению его серологической активности в РНСА.

Предлагаемый способ способствует повышению стабильности и чувствительности целевого продукта.

Заявляемые температурные и временные параметры необходимы и достаточны для достижения технического результата, так как повышение температуры выше 80^oС приводит к снижению серологической активности антигена, а при снижении ниже 70^oС и обработке менее 30 мин не достигается необходимый эффект.

Возможность практического использования заявляемого способа подтверждается примерами его конкретного выполнения.

Пример 1. 2 мл 5%-ной суспензии ПА носителя с размерами частиц 1,2-1,8 мкм смешивают с 0,2-0,3 мг фракцией IA или IB чумного микроба в 2 мл 0,1 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,2. Смесь выдерживают 3 ч при температуре (22±4)^oС и периодически помешивают, осаждают и дважды промывают в ФСБ рН 7,2. Полученный диагностикум диспергируют в 40 мл ФСБ рН 7,2, содержащего 1-2% формалина. Жидкий препарат хранят в темном месте при 4-6^oС.

Серологическую активность препарата определяют в РНСА. В лунках 96-луночных планшет с U-образными лунками готовят по 0,05 мл последовательных двукратных разведении чумной агглютинирующей сыворотки в 0,05 М ФСБ рН 7,0-7,4. Затем в лунки вносят по одной капле суспензии диагностикума.

Микропланшету встряхивают, оставляют в покое при температуре (22±4)^oС и через 2-3 ч учитывают результат реакции по феноменам "зонтик"- "пуговка". Диагностикум выявляет антитела в титре 1:200 тыс.-1:400 тыс.

С целью экспресс-диагностики ставят РНСА на стекле.

На обезжиренное предметное стекло наносят 1-2 капли исследуемой сыворотки и 1 каплю диагностикума. Пробу тщательно перемешивают и через 2-5 мин учитывают результат реакции. При наличии в пробе специфических антител к фракции I чумного микроба наблюдается агглютинация полиакролеиновых микросфер. В контроле суспензия диагностикума остается гомогенной.

Пример 2. Получение диагностикума чумного полиакролеинового антигенного жидкого, а также постановку серологических реакций с ним проводили аналогично способу, описанному в примере 1, за исключением того, что после сенсибилизации фракцией I полиакролеиновых микросфер в течение 3 ч полученную суспензию дополнительно прогревали при 70-80^oС и перемешивали в течение 30-40 мин.

В таблице приведены сравнительные показатели чувствительности и стабильности диагностикумов, полученных по способам прототипа и заявляемому.

Таким образом, заявляемый способ имеет преимущества перед прототипом, так как обеспечивает получение чумного полиакролеинового антигенного диагностикума с более высокой чувствительностью и сроком сохранения активности.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в получении высокочувствительных и стабильных диагностикумов. Способ предусматривает сенсибилизацию суспензии окрашенных полиакролеиновых частиц антигеном чумного микроба фракции I, перемешивание смеси, нагрев смеси до 70-80^oС, осаждение и отмывку диагностикума. Полученный предложенным способом диагностикум более чувствителен и имеет более длительный срок хранения. 1 табл.

Способ получения чумного антигенного диагностикума, включающий сенсибилизацию суспензии окрашенных полиакролеиновых частиц антигеном чумного микроба, перемешивание смеси в течение 3 ч, осаждение и отмывку диагностикума, отличающийся тем, что сенсибилизацию проводят антигеном фракции I чумного микроба при соотношении 0,1-0,3 мг антигена на 100 мг полиакролеиновых частиц в 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,0-7,4 и смесь дополнительно подвергают нагреванию до 70-80^oС, перемешивают в течение 30-40 мин и отделяют несвязавшийся с частицами антиген фракции I отмывкой 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН 7,0-7,4.