СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРЕПОНЕМНОГО АНТИГЕННОГО ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/571 

Описание патента на изобретение RU2139539C1

Изобретение относится к области медицины, а именно к получению диагностикумов.

Используемые в серодиагностике сифилиса и других инфекций эритроцитарные диагностикумы состоят из сенсибилизированных антигенами эритроцитов [1].

Однако в связи с тем, что эритроциты природного, органического характера, стабильность и специфичность приготовленных на их основе диагностикумов невысока.

В связи с этим начали применять полимерные носители с заданным диаметром частиц с отсутствием рецепторов различной специфичности.

Известен способ получения диагностикума на основе полистирольных латексов с сенсибилизированным на них бруцеллезным антигеном [2]. С целью повышения эффективности иммобилизации носители обрабатывались путем активации полистирольных карбоксильных групп глутаровым альдегидом. Буферную смесь суспензий полистирольного латекса и антигена подвергали сенсибилизации на магнитной мешалке в течение 12 - 16 ч с последующей отмывкой не связавшихся агентов и ресуспензированием с использованием в качестве стабилизатора бычьего сывороточного альбумина (БСА).

Недостатком способа является длительность получения диагностикума и реакции агглютинации с его использованием, неблагополучная экологическая атмосфера процесса.

В последнее время активно развиваются разработки диагностикумов, в которых в качестве носителей используются полиакролеиновые латексы, содержащие альдегидные группы.

Известен способ получения полигруппового иммуноглобулинового диагностикума к возбудителям особо опасных инфекций (чума, сап, мелиоидоз, тулеремия, бруцеллез) [Пат. РФ N 2012888, G 01 N 33/531, 15.05.94, Бюл. N9].

Согласно этому способу полиакролеиновые частицы размером 1,8 мкм, сенсибилизированные иммуноглобулинами полигрупповой сыворотки, на 10 мг латекса 0,1 мг глобулинов, ингибированием в магнитной мешалке при pH 7,0-7,4 в течение 4 ч в комнатной температуре и 12 ч при 4oC при постоянном перемешивании, затем смесь отмывают ФСБ, осадок ресуспензируют с использованием БСА, диагностикум лиофильно высушивают.

Диагностикум, полученный этим способом, обеспечивает сокращение времени проведения иммунологического анализа.

Использование свойств полиакролеина в антиген-антителоноситель в гравитационном поле позволило разработать экспрессный метод (20-30 мин) индикации бактериальных антигенов в реакции агглютинации путем центрифугирования [Пат. РФ N 2102761, з. N 94043032/13, G 01 N 33/569, 20.01.98, Бюл. N 2].

Однако процесс получения диагностикума длителен.

Наиболее близким по назначению является способ получения диагностикума для использования в иммунологических реакциях на сифилис [ЕР N 0718627, G 01 N 33/571, 26.06.96]. Способ включает сенсибилизацию латекса антигеном и подготовку диагностикума, при этом в качестве латекса используют инертные полистироловые частицы, а в качестве антигена - Treponema pallidum.

Однако при приготовлении диагностикума требуется предварительная активация полистирольного носителя, значительно удлиняющего время приготовления диагностикума, недостаточная демонстративность из-за отсутствия окрашивания, длительное время анализа.

Целью изобретения является сокращение времени получения диагностикума и времени реакции агглютинации, повышения демонстративности реакции, улучшение экологических условий процесса.

Поставленная цель достигается тем, что полиакролеиновые частицы диаметром 0,6-1,6 мкм окрашивают красителем, затем сенсибилизируют антигеном ультраозвученных трепонем, при этом на 10 мг частиц используют 0,016-0,03 мг антигена.

Краситель выбирают из класса основных красителей ксантенов.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки: использование в качестве латекса полиакролеиновых частиц, что обеспечивает сокращение времени сенсибилизации антигена за счет исключения процесса обработки глутаровым альдегидом. Это обусловлено тем, что иммобилизация антигенов легко осуществляется за счет ковалентного связывания альдегидных групп полиакролеинового носителя с аминогруппами ультраозвученных трепонемных антигенов. Окрашивание красителем улучшает демонстративность процесса.

Использование более мелких частиц латекса по сравнению с известными решениями (0,6-1,6) обеспечивает более высокую сорбционную емкость диагностикума и соответственно ускорение иммунной реакции.

Использование частиц менее 0,6 мкм нецелесообразно, т.к. может привести к агломерации.

Соотношение объемов частиц и антигена составляет 0,016-0,03 мг антигена на 10 мг латекса, обеспечивает достаточную сорбционную емкость диагностикума в реакции антиген - антитело.

Выбор красителя из класса основных красителей группы ксантенов (метиленовый синий, толуидиновый синий, пиронин, гематоксилин и др.) обусловлен тем, что эти красители содержат амино-, имино- и другие группы, придающие им свойства оснований. При взаимодействии ионизированными группами окрашиваемого материала образуются соли, обеспечивающие прочное окрашивание. Эти красители используются для окрашивания базофильных структур в гистологических исследованиях [БМЭ, М, 1978, тт.6, 19].

Способ осуществляется следующим образом.

В 2,5-7,5% водный раствор полиакролеинового латекса с диаметром частиц 0,6-1,6 мкм добавляют 0,01 мас.% красителя пиронин-Ж. Смесь перемешивают 2 часа при комнатной температуре, дважды промывают дистиллированной водой (ДВ) центрифугированием, диспергируют до исходной концентрации, суспензию хранят при температуре 4-6 градусов. Суспензию антигена 0,15-0,25 мг в 2 мл 0,1 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) pH 7,2 смешивают в равных количествах с суспензией латекса, добавляют такое же количество физиологического раствора поваренной соли (ФР).

Сенсибилизацию проводят 3 часа при комнатной температуре на магнитной мешалке, осаждают и дважды промывают в ФСБ. Полученный диагностикум диспергируют до исходного объема, разливают в ампулы и лиофильно высушивают. Лиофилизированные препараты хранят в запаянных ампулах при температуре 4-8 градусов.

Пример 1. Готовят 2,5% суспензию полиакролеиновых частиц диаметром 0,6 мкм (2,5 г частиц в 100 мл воды), добавляют 0,25 мг красителя пиронина-Ж, смесь перемешивают 2,5 часа при комнатной температуре, дважды. Промывают центрифугированием ДВ и доводят объем частиц до 100 мл. В 2 мл 0,1 М ФСБ размешивают 0,15 мг ультраозвученного трепонемного антигена, добавляют 2 мл суспензии окрашенного латекса и 2 мл ФР. Сенсибилизацию проводят 3 часа при комнатной температуре на магнитной мешалке, осаждают и дважды промывают на центрифуге при 4 тыс. об/мин в течение 10 минут в ФСБ. Реакцию латексной агглютинации проводят на стекле, добавляя к 20 мкл сыворотки 10 мкл диагностикума. Наличие трепонемных антител в исследуемой сыворотке определяется при флокуляции суспензии с четкими зонами просветления в течение 5 минут.

Пример 2. Выполняется аналогично примеру 1 за исключением того, что готовят 5% раствор латекса с размером частиц 1,2 мкм с добавлением 0,5 мг красителя, суспензия антигена содержит 0,20 мг ультраозвученных трепонем. Время реакции составляет 3 минуты.

Пример 3. Выполняют аналогично примеру 1 за исключением того, что готовят 7,5% раствор латекса с размером частиц 1,6 мкм, с добавлением 0,75 мг красителя, суспензия антигена содержит 0,25 мг ультраозвученных трепонем. Время реакции составляет 4 минуты.

Пример 4. Использование диагностикума для постановки реакции латексной агглютинации на стекле.

На обезжиренное предметное стекло наносят 1-2 капли исследуемой сыворотки и одну каплю диагностикума, полученного по примеру 2. Пробу тщательно перемешивают стеклянной палочкой и через 3 минуты учитывают результат реакции. При наличии в пробе специфических антител к трепонемам наблюдается флокуляция суспензии диагностикума с четкими зонами просветления. При отрицательной реакции суспензия диагностикума остается гомогенной. С контрольными нормальными сыворотками диагностикум дает отрицательную реакцию.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование позволяет организовать экологически допустимую технологию производства трепонемного диагностикума в 3-4 раза короче, чем по прототипу. С полученным по изобретению диагностикумом ускоряется реакция агглютинации латекса и повышается ее демонстративность. Это позволит проводить массовую экспресс-диагностику сифилиса среди широких слоев населения, что актуально в наступающей эпидемии этой инфекции.

Похожие патенты RU2139539C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА (ВАРИАНТЫ) 1999
  • Базиков И.А.
  • Тюменцева И.С.
  • Ефременко В.И.
  • Афанасьев Е.Н.
  • Жарникова И.В.
RU2200327C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА СУСПЕНЗИОННОГО ЧУМНОГО АНТИГЕННОГО НА ОСНОВЕ ФРАКЦИИ I 2001
  • Зайцев А.А.
RU2199750C2
СПОСОБ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ЛАТЕКСНОЙ АГГЛЮТИНАЦИИ 2001
  • Зайцев А.А.
  • Бинатова В.В.
RU2198407C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАТЕКСНЫХ АНТИГЕННЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БРУЦЕЛЛЕЗА, ТУЛЯРЕМИИ 2021
  • Евченко Анна Юрьевна
  • Жарникова Ирина Викторовна
  • Курчева Светлана Александровна
  • Русанова Диана Владимировна
  • Пономаренко Дмитрий Григорьевич
  • Катибина Ирина Сергеевна
  • Кошкидько Александра Геннадьевна
  • Жарникова Татьяна Владимировна
  • Курноскина Мария Михайловна
  • Жданова Елена Владимировна
  • Семирчева Анастасия Александровна
RU2777803C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАТЕКСНОГО ДИАГНОСТИКУМА 1991
  • Смелянский В.П.
  • Зыкин Л.Ф.
  • Манолов А.Д.
  • Мананков В.В.
  • Зайцев А.А.
RU2012888C1
ГЕМАГГЛЮТИНАЦИОННЫЙ ТЕСТ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА 2006
  • Чепурченко Наталья Валерьевна
  • Обрядина Анна Петровна
  • Уланова Татьяна Ивановна
  • Бурков Анатолий Николаевич
RU2305842C1
Способ получения бруцеллезного полистирольного латексного диагностикума 2022
  • Курноскина Мария Михайловна
  • Жарникова Ирина Викторовна
  • Русанова Диана Владимировна
  • Курчева Светлана Александровна
  • Кошкидько Александра Геннадьевна
  • Даурова Алина Викторовна
  • Пономаренко Дмитрий Григорьевич
  • Жданова Елена Владимировна
  • Жарникова Татьяна Владимировна
  • Беседин Артём Викторович
RU2798124C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАГНОИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ 2003
  • Кальной С.М.
  • Жарникова И.В.
  • Зайцев А.А.
RU2246968C2
КОМПОЗИТНЫЙ ЧУМНОЙ АНТИГЕННЫЙ F1-ДИАГНОСТИКУМ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ 2015
  • Бойко Андрей Виталиевич
  • Киреев Михаил Николаевич
  • Осина Наталья Александровна
  • Куклев Василий Евгеньевич
RU2582941C1
СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА НА ОСНОВЕ РЕАКЦИИ ЛАТЕКС-АГГЛЮТИНАЦИИ 1998
  • Гизатулина Н.М.
  • Головлев И.Р.
  • Хлебников В.С.
  • Зимин А.Е.
  • Прокопов Н.И.
RU2130615C1

Реферат патента 1999 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРЕПОНЕМНОГО АНТИГЕННОГО ДИАГНОСТИКУМА

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения диагностикумов. Способ основан на сенсибилизации частиц латекса антигеном. При этом в качестве латекса используют окрашенные полиакролеиновые частицы с диаметром 0,6-1,6 мкм, а в качестве антигена - антиген ультраозвученных трепонем. При сенсибилизации 10 мг латекса используют 0,016-0,03 мг антигена. Способ позволяет получить диагностикум с высокой демонстративностью, позволяет сократить время получения препарата и время диагностики.

Формула изобретения RU 2 139 539 C1

Способ получения трепонемного антигенного диагностикума, включающий сенсибилизацию латекса антигеном, подготовку диагностикума, отличающийся тем, что в качестве латекса используют полиакролеиновые частицы с диаметром 0,6 - 1,6 мкм, которые окрашивают красителем, а затем сенсибилизируют антигеном, в качестве которого используют антиген ультраозвученных трепонем, при этом на сенсибилизацию 10 мг латекса используют 0,016 - 0,03 мг антигена.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1999 года RU2139539C1

Центробежный насос 1978
  • Александров Станислав Леонидович
  • Павлович Лев Анатольевич
SU718627A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАТЕКСНОГО ДИАГНОСТИКУМА 1991
  • Смелянский В.П.
  • Зыкин Л.Ф.
  • Манолов А.Д.
  • Мананков В.В.
  • Зайцев А.А.
RU2012888C1
RU 94043032 C1, 20.02.97
RU 94023831 A1, 27.09.96
Устройство для выборки слабины в канатах судоподъемных устройств на волнении 1972
  • Бугаенко Борис Андреевич
  • Богданов Владимир Леонидович
SU447322A1
US 4618588 A, 21.10.86
Биомедицинские технологии
ММА им.И.М.Сеченова
- М.: Медицина, 1994.

RU 2 139 539 C1

Авторы

Базиков И.А.

Даты

1999-10-10Публикация

1997-05-20Подача