Изобретение относится к биотехнологии, а именно к диагностическим методам анализа растений, и может применяться в культуре растительных клеток, тканей и протопластов для идентификации цибридов или гибридов различной асимметрии с чужеродной цитоплазмой.
Цель изобретения - упрощение технологии выявления цибридов и сокращение длительности процесса.
Способ состоит в том, что у родительских форм и растений-регенеран- тов, полученных при соматической гибридизации, выделяют протопласты, измеряют их фотосинтетическую активность и по ней идентифицируют цибриды.
Растения выращивают на безгормональной среде Мурасиге-Скуга при 24- 25аС и освещенности 2000 ли.
Пример 1. Источником протопластов берут асептически выращиваемые растения сорта Зарево. Листья нарезают узкими полосами шириной 1- 2 мм к переносят на поверхность фер- менткого раствора. Для ферментации используют раствор, содержащий 1% Cellulisine, 0,5% Macerase, 0,5 М сахарозу и 5 мМ СаС12, рН 5,6. Листья инкубируют 14-16 ч в темноте при 28 С. Протопласты фильтруют через сито с диаметром пор 60-100 мкм. Фильтрат центрифугируют 2-3 мин при 150 д. Протопласты, плавающие на поверхности раствора, собирают пастеровской пипеткой и переносят в другую пробирку..К суспензии протопластов (0,5-1 мл.) при перемешивании добавляют 8-10 мл среды U 5 (NaCl - 9 г/л; СаС12 13,9 г/л; КС1 - 0,8 г/л} глюкоза 1 г/л; рН 5,7). Центрифугио:ее
о
sj
о
СО
руют 3 мин при 80-100 д. Надосадоч- ную жидкость удаляют. Процедуру повторяют дважды.
П р и м е р 2. Источником протопластов берут асептически выращиваемые растения дикого вида картофеля Solarium pinnatisectum. Протопласты выделяют указанным способом.
П р и м е р 3. Источником протопластов служат асептически выращиваемые растения-регенеранты, полученные в результате соматической гибридиза- | ции протопластов сорта Зарево и протопластов дикого вида S.pinnatisectum. Интенсивность флюоресценции протопластов определяют на флюори- метре Плотность суспензий протоплас-1 тов уравнивают визуально по интенсивности окраски, добавляя среду W 5. Конечный объем суспензий 50-70 мл. Суспензию протопластов в объеме 5 мл1 сорта картофеля Зарево помещают в кювету флюориметра и возбуждают флюоресценцию хлорофилла светом в широкой области спектра (400-640 нм). Снимают показания интенсивности флюоресценции хлорофилла (Фл) протопластов. Затем в кювету добавляют раствор, содержащий гербицид симазин,
блокирующий фотосинтез. Конечная концентрация симазина в кювете IX
моль/л. Снимают показания. По разнице показаний интенсивности флю- оресценции хлорофилла протопластов до (Фл) и после добавления симазина (Фл + симаз) определяют относитель- ную интенсивность флюоресценции (Иф) по формуле
Иф
(Фл + симаз)Фл Фл f симаз
Измерения проводят в 3-4 кратной повторностях. Результаты измерений , заносят в таблицу. Интенсивность флю- 4оресценции протопластов S.pinnatisectum измеряют указанным способом. Затем измеряют интенсивность флюоресценции хлорофилла протопластов рас- тений-регенерантов.
Цибриды-растения с хлоропластами дикого вида S.pinnatisectum имеют интенсивность флюоресценции, сходную с протопластами дикого вида, и превышают интенсивность флюоресценции протопластов сорта Зарево. По раз- ,
Q нице в интенсивности флюоресценции протопластов родительских форм растений и регенерантов отбирают цибрид- ные линии.
Б табл. 1 приведены данные интен j сивности фотосинтеза родительских форм растений и отобранных цибридов линии Sp 10, Sp 13, Sp 21.
Для контроля выявленные с помощью указанного способа цибриды линий:
0 Sp 10, Sp 13, Sp 21, проверяют путем рестриктного анализа их хл ДНК.
Из сравнения спектров хл ДНК можно отметить рестриктные спектры хл ДНК Sp 10, Sp 13, Sp 2 идентичные спект5 Рам хл ДНК S.pinnatisectum, что свидетельствует о цибридной природе отобранных линий.
Таким образом, предлагаемый способ является достоверным способом выявлеQ ния цибридов. Способ позволяет упростить технологию выявления цибридов среди растений-регенерантов, полученных при соматической-гибридизации, сократить затраты труда, времени и средств.
5 формула изобретения
Способ выявления цибридов среди растений-регенерантов, полученных при соматической гибридизации, вклю0 чающий идентификацию хлоропластов, характерных для растений-доноров, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии выявления цибридов и сокращения длительное-
5 ти процесса, для идентификации выделяют протопласты родительских форм и растений-регенерантов и проводят измерение интенсивности флюоресценции Их хлорофилла, по которой ведут отбор цибридов.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ получения растений с чужеродной цитоплазмой | 1988 |
|
SU1604276A1 |
| Способ получения растений-регенерантов картофеля из протопластов | 1988 |
|
SU1604275A1 |
| СПОСОБ СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР | 1997 |
|
RU2125365C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ С КОМПЛЕКСНОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ФИТОСТЕРИНЗАВИСИМЫМ ВРЕДИТЕЛЯМ | 1996 |
|
RU2141196C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ СОРГО С ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТЬЮ | 1995 |
|
RU2080058C1 |
| ХИМЕРНЫЙ ГЕН, СОДЕРЖАЩИЙ ЕГО РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВЕКТОР И СЕМЕННОЙ МАТЕРИАЛ, И СПОСОБЫ, ПРЕДУСМАТРИВАЮЩИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭТОГО ГЕНА | 1995 |
|
RU2266332C2 |
| МАНИПУЛИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТОПОРФИРИНОГЕНОКСИДАЗЫ У ЭУКАРИОТ | 1995 |
|
RU2192468C2 |
| ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ МУТАНТНЫХ KRP У РАСТЕНИЙ | 2012 |
|
RU2631790C2 |
| ФРАГМЕНТ ДНК (ВАРИАНТЫ), СЛИТЫЙ ФРАГМЕНТ ДНК ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В РАСТЕНИЯХ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННОГО РАСТЕНИЯ И ЕГО ПОТОМКОВ | 1989 |
|
RU2130491C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УСТОЙЧИВЫХ К СУЛЬФОНИЛМОЧЕВИННЫМ ГЕРБИЦИДАМ ДВУДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ | 1987 |
|
RU2099422C1 |
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к диагностическим методам анализа растений,и может применяться в культуре растительных клеток, тканей и протопластов для идентификации цибридов или гибридов различной асимметрии с чужеродной цитоплазмой. Целью изобретения является упрощение технологии выявления цибридов и сокращение длительности процесса. Способ состоит в том, что выделяют протопласты родительских форм и регенерантов, определяют их фотосинтетическую активность и по ней иден- . тифицирзтот цибриды. 1 табл.
