Способ получения иммуностимулятора Советский патент 1991 года по МПК A61K35/74 

Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности и касается способа получения иммуностимулятора пролонгированного действия на основе пептидгликана, выделяемого из клеточных стенок бактерий.

Целью изобретения является повышение удельной активности и увеличение продолжительности действия.

Пример 1. Получение модифицированного иммуностимулятора.

В качестве исходного сополимера используют совиаль - сополимер винилпирроли- дона с диэтилацеталем акролеина, который превращают в сополимер со свободными альдегидными группами следующим образом. Раствор 1,8 г совиаля в 80 мл 0.01М соляной кислоты в течение 2 ч нагревают на кипящей водяной бане. Полученный раствор охлаждают и нейтрализуют 4 М едким

натром до рН 7,5-8,5, после чего к нему добавляют 0,1 М боратный буфер с рН 8,5- 9,5 до объема 180 мл. К 7 мл полученного раствора (что соответствует 70 мл исходного сополимера) добавляют 40 мг лиофильно высушенного препарата пептидгликана. Раствор выдерживают в течение 2-4 ч при комнатной температуре, после чего добавляют 10 мг боргидрида натрия и через 1 час концентрируют раствор до объема 3 мм, промывают двукратно 10 мл воды. Раствор лиофильно высушивают и определяют содержание пептидгликана в сухом препарате по аминокислотному анализу.

Примеры 2-4. Следующие образцы модифицированного иммуностимулятора получают аналогично примеру 1 при измененных соотношениях исходных реагентов и различных способах нейтрализации альдегидных групп, как это показано в табл. 1.

оэ со

о оо со

Пример 5. Получение модифицированного стимулятора с пониженным содержанием белка.

Препарат пептидгликана растворяют в воде до концентрации 2,3 мг/мл (оптическая плотность при 280 нм 1,2) и фильтруют раствор через мембрану РМ-10 с минимально удерживаемой мол. мае. 10000. Оптическая плотность фильтрата, содержащего пептид- гликан, 0,05, т. е. практически весь белок остается в концентрате над мембраной.

К 20 мл полученного фильтрата добавляют 30 мл раствора гидролизованного сополимера (концентрация 3 мг/мл) и выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Затем добавляют 20 мг солянокислого гид- роксиламина и через 1 ч концентрируют раствор с использованием мембраны РМ-10, концентрат подвергают лиофилизации.

Пример 6. Определение иммуностимулирующей активности образцов.

Определение проводят на мышах-гибридах Fi (CBAxC57/BL). Образцы препаратов вводят однократно внутривенно в дозах 5,0 и 0,5 мг на 1 кг веса животного в 0,5 мл стерильного физраствора. Животным контрольных групп вводят эквивалентное количество растворителя. Число антителообразующих клеток селезенки (АОК) оценивают методом локального гемолиза на пятые сутки после иммунизации мышей эритроцитами барана в дозе 10 клеток на мышь. Достоверность различий оценивают по критерию / Фишера- ( i ыодента.

Результаты исследования приведены в iao.1. 2.

Из данных, представленных в табл. 2, видно, что при использовании иммуностимулятора, полученного по предлагаемому способу, для достижения эффекта, получаемого при использовании известного способа, требуются меньшие дозы (в 10 раз).

Пример 7. Оценка иммуностимулирующей активности по индукции интерлейкина-2.

0

0

5

0

Адъювантное действие известных иммуностимуляторов связано с их способностью вызывать индукцию образования интерлей- кина-1 клетками моноцитарного ряда и ин. терлейкина-2 (ИЛ-2) Т-клетками. Поэтому в качестве тест-системы для сравнительного изучения иммуностимулирующей активности препарата, полученного по предлагаемому способу, используют также анализ уровней ИЛ-2 после введения препарата животным. Препараты вводят животным внутрибрю- шинно в дозе 5 мг/кг. Через 1, 3, 5 и 10 сут клетки селезенок мышей эксплантируют «ин витро и исследуют продукцию ИЛ-2 в ответ на конканавалин А (КонА) (1 мкг/мл).

Результаты исследований приведены в табл. 3.

Из данных, приведенных в табл. 3, видно, что введение препарата вызывает гиперпро- дукцир ИЛ-2 селезеночными клетками мыши. При этом ИЛ-2 - индуцирующее действие пептидгликана по известному способу проявляется через 5 сут, но практически прекращается через 10 сут, в то время как введение препарата, полученного по предлагаемому способу, приводит к сохранению эффекта в течение 10 сут, т. е. к пролонгированному действию.

Формула изобретения

Способ получения иммуностимулятора, включающий выделение пептидгликана Lac- tobacillus bulgaricus LB-51 с последующим сублимированием, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности и увеличения продолжительности действия, перед сублимированием пептидгликан подвергают ультрафильтрации на мембранах с минимально удерживаемой мол. м. 5000- 10000 j и обработке водным раствором сополимера N-винилпирролидона с акролеином при массовом соотношении пептидгликан - полимер 1:1-3.

Таблица 1

Таблица 2

Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности и касается способа получения иммуностимулятора пролонгированного действия на основе пептидгликана, выделяемого из клеточных стенок бактерий. Цель изобретения - повышение удельной активности и увеличение продолжительности действия. Для этого выделяют пептидгликан Lactobacillus bulgaricus, подвергают его ультрафильтрации на мембранах с минимально удерживаемой мол. м. 5000-10000 и отработке водным раствором сополимера М-винилпирролидона с акролеином при массовом соотношении пептидгликан - полимер 1:(1-3) с последующим сублимированием. Ј

Таблица 3