Способ определения иммунореактивности животных Советский патент 1991 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и биохимии, в частности, к разработке способа опаределения иммуноре- активности организма.

Цель изобретения - повышение чувст- вительтности способа.

Для этого используя в качества материала суспензию лейкоцитов и лимфоцитов крови, определяют вяло реагирующие экра- низованные SH-группы на их поверхности путем добавления к титруемой суспензии клеток в качестве детергента мочевины в конечной концентрации до 1, 5-2,0 N раствора, с последующей регистрацией величины

падения силы тока, пропорциональной количеству высвобождающихся вяло реагирующих SH-rpynn, а учет результатов проводят по сумме легко и вяло реагирующих SH-групп моль/клетка, при этом у здо- вых животных с высокой иммунореактивно- стью содержание всех SH-групп составляет 19,8 ± 0,5 моль/клетка, а у животных с иммунодефицитными состояниями ю 10 -2,5 моль/клетка.

Пример1.В пробирку, содержащую раствор ЭДТА отбирают кровь из вены животного, затем к 1,0 мл крови добавляют дистилированную воду (или гемолитическую смесь с сапонином) в отношении 1:20, перемешивают в течение 15 с и немедленно прибавляют 10-кратный раствор Хенкса для восстановления осмотического давления. Клетки осаждают центрифугированием при 400 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают и вновь прибавляют сначала дистилированную воду, а затем спустя 15 с

-м

о

СА)

А

Ю 00

раствор Хенкса и повторно осаждают центрифугированием. К осадку добавляют 15мл аммиачно-нитратного 0,1 N буфера с рН 6,8. Лимфоциты из крови выделяют методом дифференциального центрифугирования в 17%-ном растворе верографина,

Полученные суспензии клеток помещают в стаканчик объемом 30 мл и добавляют аммиачно-нитратный буфер (рН 6,8, 0,1 N) до объема 25 мл, В раствор погружают элек- троды и определяют величину исходного тока по гальванометру. Титрацию ведут раствором 0,5 М нитрата серебра по 50 мкл (0,05 мл). Способ определения SH- групп на поверхности клеток основан на том, что порции азотно-кислого серебра, реагирующие со свободными легко доступными SH-группами, связываются не вызывая при этом появления тока, Однако, как только все доступные SH-группы будут блокиро- ваны, в растворе появляются свободные ионы серебра, которые восстанавливаются на платиновом электроде, что вызывает появление диффузионного тока. Сила тока пропорциональна концентрации ионов ме- талла е растворе. Откладывая на графике силу тока против количества добавленного реагента, определяют конечную точку титрования (точку эквивалентности). Количество пошедшего раствора серебра в молях делят на число клеток в суспензии, определяя тем самым среднее содержание свободных легко реагирующих SH-групп на одну клетку, моль/клетка. Определение числа клеток проводят либо на целоскопе, либо в камере Горяева.

Затем для определения числа вяло реагирующих свободных SH-групп на поверхности лейкоцитов и лимфоцитов к титруемой пробе добавляют мочевину до конечной концентрации ее 2 N, при этом происходит разрыхление структур мембранных белков и высвобождение ранее экранированных малодоступных SH-групп, которые быстро связываются с избытком ионов серебра, находящихся в растворе, в результате чего сила тока падает пропорционально количеству высвобождающихся вяло реагирующих SH-групп. По величине снижения тока рассчитывают количество азотно-кислого серебра в молях. Эту величину делят на число клеток, определяя содержание SH-групп в молях на одну клетку. Общее количество всех свободных SH- групп в мембране равно сумме легко и вяло реагирующих SH-групп.

Так на титрацию суспензии лейкоцитов кролика, содержащую 7 106 клеток, идет 0,12-5 10 ГмольАдМОз.

Количество легко реагирующих SH-rpynn

д,12

10

-7

0,08

- 8

10

,-15

7 10° моль/клетка.

При добавлении к титруемой смеси 3 г сухой мочевины (2 N раствор) происходит в течение 5 мин снижение силы тока на 3 мА по гальвонометру. Такое снижение обуславливает связывание 0,15 -0,5 раствора азотно-кислого серебра. Содержание

0,15 5,0 10

7 10Ј

-7

вяло реагирующих SH-rpynn

10,0 моль/клетка.

Общее содержание всех свободных SH- rpynn на поверхности клеток равно сумме легко и вяло реагирующих SH-rpynn. 8 -10 15+10 18 моль/клетка.

Способ апробируют с положительным результатом на животных инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) результаты которых приведены в таблицах.

Из табл.1 видно, что у неинфицированных (здоровых) кроликов на поверхности одного лейкоцита содержится значительное количество свободных SH-rpynn (19,8 ± ± 0- 10 моль/клетка), из которых 9,8- 10 моль/клетка приходится на легко реагирующие и 10,7 на вяло реагирующие SH-группы.

У животных инфицированных ВЛ КРС отмечается резкое снижение SH-rpynn на поверхности лейкоцитов в 2-3 раза. Это снижение происходит как за счет легко реагирующих, так и вяло реагирующих SH- rpynn, У 82% от числа инфицированных ВЛ КРС кроликов содержание легко реагирующих SH-групп снижается в 2-8 раз в сравне- нии с неинфицированными. У 43% содержание вяло реагирующих SH-rpynn снижается в 2,5-10 раз и только у 8,6% количество вяло реагирующих SH-rpynn наблюдается в пределах нормы. Таким образом определение легко и вяло реагирующих SH-rpynn свидетельствует о резком снижении экспрессии SH-групп в мембранных белках на поверхности лейкоцитов и лимфоцитов у животных инфицированных ВЛ КРС.

Исследования показывают (табл.2), что у одного и того же здорового кролика на протяжении около месячного наблюдения содержание легко и всех свободных SH- rpynn является величиной стабильной и колеблется по отношению к средней на 10-12%. Менее стабильным является содержание-вяло реагирующих SH-групп, количество их колеблется по отношению к средней на 32%. У инфицированных ВЛ КРС кроликов на всем протяжении наблюдения содержание SH-групп на поверхности лейкоцитов резко снижается, носит стабильный харак- тер. Колебания уровня как легко реагирующих, так и всех SH-групп вокруг средней составляет 40-53%, а вяло реагирующих SH-групп - 75%. Эти исследования свидетельствуют о том, что у животных, инфици- рованных ВЛ КРС происходят глубокие и стойкие изменения мембран лейкоцитов, что ведет к снижению силы иммунного ответа на тимусзависимые и тимуснезависимые антигены.

Из табл.3 видно, что у инфицированных ВЛ КРС кроликов отмечается выраженное снижение легко реагирующих SH-групп в иммуноглобулинах класса G в 2,5 раза и одновременно снижение титров нормаль- ных антител G класса в 6 раз. Между сниже- нием SH-групп в иммуноглобулинах, уменьшением SH-групп на поверхности лейкоцитов и снижением титров нормальных антител отмечается сильная кореляци- онная связь. На основании изменения как лейкоцитов и лимфоцитов, так и иммуноглобулинов видно, что при инфицировании ВЛ КРС снижение иммунореактивности обусловлено как снижением клеточного, так и гуморального иммунитета.

В табл.4 приведены данные, свидетельствующие, что в ответ на введение экзогенных липидных перекисей, полученных из льняного масла, в организме кроликов происходит резкое усиление интенсивности свободно- радикальных процессов в липидэх с резким повышением в крови и тканях продуктов перекисного окисления липидов. При этом, как видно из табл.4 происходят существен- ные изменения содержания легко и вяло реагирующих SH-групп как на поверхности лейкоцитов и лимфоцитов, так и в иммуноглобулинах класса G. Оказывается, что наиболее уязвивым по отношению продуктов перекисного окисления липидов является гуморальный иммунитет. Об этом свидетельствуют снижение SH-групп в иммуноглобулинах уже через 24 ч, падение титров нормальных антител через 48 ч, тогда как изменения со стороны SH-групп на поверхности лейкоцитов наступают намного позже (8 сут). Усиление процессов ПОЛ в организме таким образом ведет к резкому снижению иммунореактивности. С помощью определения SH-групп в иммуноглобулинах и на поверхности лейкоцитов можно выявить степень поражения при этом клеточного и гуморального иммунитета.

В табл.5 представлены данные по динамике содержания SH-групп на поверхности лейкоцитов у кроликов инфицированных ВЛ КРС с выраженными явлениями иммунодефицита после введения в качестве иммуно- корректора вакцины из коринебактерий КТ-26.

Из табл.5 видно, что уже через сутки после введения вакцины резко возрастает содержание SH-групп на поверхности лейкоцитов в 2,5-3 раза (на 3 сут в 4 раза). У животных неинфицированных с нормальной иммунореактивностью увеличения SH- групп на поверхности лейкоцитов практически не отмечается.

Формула изобретения

Способ определения иммунореактивности животных, включающий определение легко реагирующих SH-rpynn в суспензии клеток путем проведения амперометриче- ского титрования раствором азотнокислого серебра последующим учетом результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, из клеток используют лейкоциты и лимфоциты, дополнительно проводят определение вяло реагирующих экранированных SH-групп путем добавления к суспензии клеток мочевины до конечной концентрации 1,5-2,0 N, учет результатов проводят по сумме легко и вяло реагирующих SH-групп, при этом при значении 19,8 ±0,5 моль/клетка животных считают с высокой иммунореактивностью, а при 2,5 ±10,0 моль/клетка - с иммунодефицитным состоянием.

Таблица 1

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и биохимии, в частности к разработке способа определения иммунореактивности организма. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Для этого в качества испытуемого материала используют суспензию лейкоцитов и лимфоцитов крови, на поверхности которых проводят определение свободных легко реагирующих сульфгидрильных групп и дополнительно вяло реагирующих экранированных SH-групп путем добавления к титруемой суспензии клеток мочевины в концентрации до 1,5-2,0 н. раствора, с последующей регистрацией величины падения силы тока. При этом у животных с высокой иммунореактив- ностью содержание SH-групп составляет 19,8 ±0,5 10 моль/клетка, а у животных с иммунодефицитными состояними - 10 1015 - 2,5 моль/клетка. 5 табл.

Содержание свободных сульфгидрильных групп на поверхности лейкоцитов у здоровых и инфицированных ВЛ КРС кроликов, моль/клетка

Таблица 2

Динамика содержания легко и вяло реагирующих SH-групп на поверхности лейкоцитов у одного и того же животного на протяжении 3-месячного наблюдения у здоровых и инфицированных ВЛ КРС кроликов

Взаимосвязь между содержанием SH-rpynn на поверхности лейкоцитов, количеством SH-групп в иммуноглобулинах класса G и титрами нормальных антител в сыворотке крови у неинфицированных и инфицированных

ВЛ КРС кроликов

Динамика содержания SH-групп на поверхности лейкоцитов, в иммуноглобулинах класса G и титров нормальных антител у здоровых кроликов после введения им в/м продуктов перекисного окисления льняного масла

Таблица 3

Таблица 4

Динамика содержания свободных легко и вяло реагирующих SH-rpynn

на поверхности лейкоцитов и лимфоцитов кроликов инфицированных ВЛ КРС после однократного введения 2 млрд. взЪеси убитых коринебактерий (приведена аналогичная динамика у здоровых

кроликов)

Продолжение табл. 4

Таблица 5