Способ определения сульфгидрильных групп в клетках крови Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицинской биохимии, а именно к определению сульфгидрильных групп в клетках крови. Известен способ определения сульф гидрипьных групп 6 клетках крови путем добавления к ним индикатора -1 J. .Однако этот способ, выявляет лишь внутриклеточно расположенные сульфгидрильные группы и носит качественный характер. Цель изобретения - определение сульфгидрильных групп на поверхности мембран клеток крови. Эта цель достигается тем, что. согласно способу определения сульфгидрильных групп в клетках крови путем добавления к ним индикатора, определяют скорость перемещения клеток кро ви в постоянном электрическом поле до и после добавления к ним раствора двухлористой ртути в конечной концентрации 0,60-0,65 и количество сульфгидрильных групп на поверх ности мембран клеток крови (N)опреде ляют по формуле 6 L-a (V2 - V), N 6,48-10 где L - длина измерительной ячейки, см; V - разность потенциалов на кон цах ячейки. В; V - скорость, с которой исследуемая клетка перемещается в постоянном электрическом поле до добавления раствора дв;;(хлористой ртути, мкм/с, V, - скЬрость, с которой исследуемая клетка перемещается в постоянном электрическом поле после добавления раствора двухлористой ртути, мкм/с; а - радиус исследуемой клетки, Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Венозную кровь стабилизируют в пробирке 3,8%-ным раствором цитрата натрия в соотнощении 4:1. Определяют содержание эритроцитов и гематокрит стандартными методами. Эритроциты осаждают центрифугированием крови при 1000 об/мин в течение 10-12 мин Плазма отделяется. Осажденные эритро циты разливают в две центрифужные пробирки по 0,5 мл. К ним добавляют 1 9 по 5 МП буфера Михаэлиса. После перемешивания смесь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидк.ость удаляют.В первую пробирку добавляют 0,25 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия (контроль), во вторую - 0,25 мл 0,62 10 М раствора двухлористой ртути на 0,9%-ном растворе хлористого натрия (опыт). После перемешивания смесь инкубируют 3-4 мин при комнатной температуре. После этого эритроциты отмывают буфером Михаэлиса. Из отмытых эритроцитов 0,02 мл разводят в 500 раз буфером Михаэлиса и используют для определения электрофоретической подвижности стандартным методом. Содержание сульфгидрильных групп рассчитывается по вышеприведенной формуле. Пример. В пробирку, содержащую 1 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия, добавляют 4 мл венозной крови больного. После перемешивания определяют содержание в ней эритроцитов и гематокрит. В данном случае они равняются 3,5 -10 в 1 мм и 38% соответственно. После центрифугирования крови при 1000 об/мин в течение 12 мин отделившаяся плазма удаляется. Осевшие эритроциты разливают в две пробирки по 0,5 мл, к ним добавляют по 5 мп буфера Михаэлиса, После перемешивания и центрифугирования в течение 10 мин надосадочную жидкость удаляют, а к эритроцитам в первой пробирке добавляют 0,25 МП 0,9%-ного раствора хлористого натрия, а во второй 0,25 МП 0,6210Т раствора двухлористой ртути на 0,9%-ном растворе хлористого натрия.После перемешивания и выдерживания при комнатной темпераТ5фе эритроциты в обеих пробирках отмьшают буфером Михаэлиса. Из обеих пробирок по 0,02 МП эритроцитов переносят в пробирки с- 10 мп буфера. Полученную взвесь используют для определения скорости перемешивания эритроцитов в электрическом поле. Определяют время, за которое клетки переместятся на расстояние 43 мкм. Для контрольных эритроцитов оно равнялось 3,28 с, для опыта - 2,84 с (среднее время из 20 измерений). Значение остальных параметров, входящих в формулу расчета для данных ус3ловий, равно:а - 3,6 мкм, L - А см, V - 25 В. Отсюда содержание сульфгидрильны групп в исследованных эритро1щтах равно 27,2.. Предлагаемый способ используют для исследования эритроцитов донорс кой и фибринолизной крови. Содержание сульфгидрильных групп на мембра нах донорских эритроцитов 20,1+ t1,0510, фибринолизных эритроцитов - 20,4+0,. В процессе хранения крови содерж ние свободных сульфгидрйльньк групп на поверхности цитрплазматической мембраны донорских эритроцитов снижается и равняется через 7 сут 10,8+0,91-10. Предлагаемый способ используют для определения содержания сульфгид 9. 4 рильньк групп в тромбоцитах. Установлено, что в тромбоцитах донорской крови оно равно 4,37+0,5110. В процессе хранения вьщеленных тромбоцитов при 4°С содержание сульфгидрильных групп на мембранах тромбоцитов быстро уменьшается и через трое суток равняется 0,67+0,. Содержание сульфгидрильных групп на поверхности лимфоцитов, выделенных из фибринолизной крови, равняется 18,64±2,07-10. Предлагаемый способ позволяет количественно определить изменение содержания сульфгидрипьных групп на поверхности мембран клеток крови, что отражает изменение биологической активности последних в процессе хранения и открывает новые перспективы для совершенствования .способов консервирования клеток крови.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУЛЬФГИДРИЛЬНЫХ ГРУПП В КЛЕТКАХ КРОВИ путем добавления к ним индикатора, отличающийся тем, что, с целью определения сульфгидрильных групп на поверхности мембран клеток крови, определяют скорость перемещения клеток крови в постоянном электрическом поле, до и после добавления к ним раствора двухлористой ртути в конечной концент)ации 0,600,65 10Зм и количество сульфгидрильных групп на поверхности мембран клеток крови (N) определяют по формуле N 6.48-10 --