Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы Советский патент 1978 года по МПК C07G7/02 

снижает емкость матрицы по ката.литическн активному белку. По приведенным авторами данным гель состоит из 67 мол. % акрилаМИда, 32 мол. % ангидрида метакриловой кислоты со ош.иакой 0,5-1,0 мол. % N,N-lMeгилeн-быcметакриламидом или этиленгликоль.метакрилатом. Низкая степень сшивки приводит ж получению сильно набухающего геля, частицы которого имеют низкую механическую прочность. Цель описываемого сиоооба заключается в устранении недостатков известного способа и получении препаратов иммобилизованной глюкоа,милазы с высокой активностью при достаточно высоком выходе по глюкоамилаз:нои активности. Указанная цель достигается за счет того, что s качестве нерастворимой подлож:ки используют полимерные матрицы, синтезированные на основе малеинового ангидрида и гидрофильных сополимеров. Необходимо отметить, что высокая адгезия гидрофильных сополимеров позволяет получать их как в виде армированной пленки (в качестве армирующего материала могут оыть использованы синтетические ткани, металлическая сетка, гранулы инертного -материала и т. п.), так и в гранулированном виде оез лрмирующего материала. тиоолее перспективной полимерной матрицеи для мооилизации глюкоамилазы является чередующийся сополимер малеинового ангидрида и N-винилпирролидона. В качестве гидрофильных сомономеров можно использовать также акриловую и метамриловую кислоты, :акриламид, N-винилниридин. В качест:.. агентов можно использовать этиловый эфир лизина и 4,4-диаминодифенилСогласно изобретению описывается способ получения препаратов иммобилизованной глюкоамилазы посредством конденсации фермента с полимерной матрицей, в качестве которой используют сополимеры малеинового ангидрида с гидрофильными сомономерами в сшито.м виде. Процесс проводят следующим образом. К сополимеру малеинового ангидрида с гидрофильными сомономерами, растворенному в апротонном растворителе (яиметилформами. , де смеси с ацетоном), добавляют сщивающии агент в концентрации 2-аО мол. %, растворенный в апротоннам растворителе, например диметилформамиде, и получают сшитьш сополи.м.ер в виде гр-аиул или в армироаанном виде (в случае внесения армирующей иодложки). Сшитый сополимер промывают ацетоном, спиртом и эфиром и высушивают в вакууме при 120° С. Полученный сополимер вводят во взаимодействие с ультраконцентратом Культуральной жидкости End. bispora. Процесс иммобилизации проводят в течение одних-двух суток при комнатной температуре при перемешивании. Предполагаемый способ позволяет получать нерастворимые препараты глюкоамилазы, 01бладающие высокой удельной активностью и большим выходом, а воз.можность использования сополимера как в гранулированном виде, так и в армированном состоянии или в виде покрытий значительно расширяет области применения полученного :препа|рата. Пример 1. К 100 г сололимера малеиHOiBoro ангидрида и iN-винилпирролидона, растворенного в 500 мл диметилформа(МИда, добавляют 5 г 5 мол. % 4,4-диаминодифенилоксида, растворенного в 50 мл ди.метилформамида, быстро размешивают, и в раствор вносят армирующую подложку (капроновую ткань), и выдерживают :в течение 1-2 мин. Затем армированный сополимер высушивают г г В ва.кууме при 120° С. К полученному армированному сополимеру добавляют 1000 мл ультраконцентрата культуральной жидкости End. bispora и выдерживают в течение двух суток при комиатной температуре. Затем иммобилизованную глюкоамилазу на армированном сополиме,ре промывают водой и высущивают в вакууме при комнатной темлературе Глюкоамилазная активность составляет 3700-3900 сополимера. Выход по активкости составляет 60-70% от исходной, Пример 2. К 100 г сополимера малеи„030,0 ангидрида ;и N-винилпирролидан.а, растворенного в 500 мл диметилформамида, добавляют 5 г 5 мол. % 4,4-диаминодифенилоксида, растворенного в 50 мл диметилформамида, (быстро размешивают и в раствор вносят армирующую подложку (капроновую ткань), и выдерживают в течение 1-2 мин. ЗаТёмар;ми7сваннь1Г7ополимервь1сущ ивают в вакууме при 120° С. К полученному армированному сополимеру добавляют 1000 мл ультраконцентрата глюкоамилазы, разбавленного в 2 раза (15% сухих веществ), и выдерживают при комнатной температуре в течение двух суток. Глюкоамилазная активность составляет 4100-4300 ед/г сополимера. Выход по активности составляет около 90-95% от исходной. Пример 3. К 100 г сополимера малеинового ангидрида и N-винилпирролидона, растворенного ш 200 мл диметилформамида, добавляют 3,82 г 4 мол. % 4,4-диаминодифенилоксида, растворенного в 20 мл диметилформ.амида. Полученный гомогенный раствор приливают при постоянном неремешивании к 3000 мл полиэтилсилоксановой жидкости (типа ПЭС-5). Образовавшуюся эмульсию нагревают при перемешивании в течение двух часов при 80° С. Полученные сферические грапулы отфильтровывают, промывают 400 мл ацетона, смесью уксусного ангидрида с диметилформамидом (2:1) в количеспве 3QQ мл, 400 мл ацетона, 400 мл серного эфира и высушивают в вакууме при 120 °С. Выход составляет ,100 г (100%) сферических гранул диаметром 0,2-0,5 мм. К 100 г полученного гранулированного сополимера приливают 800 мл ультраконцентрата глюкоамилазы. Реакционную смесь выдерживают в течение суток при ко.мнатной темлературе и постоянном перемешивании. Препарат нммо-билизованной глюкоамилазы от|фильт1рэвывают и тщательно промывают дистиллированной водой до отрицательной реаюции на белок с 20%, раствором салициловой кислоты. Полученный препарат высушивают в вакууме при комнатной температуре.

Глюкоамилазная активность полученного препарата составляет 4200-4500 ед1г сополимера. Вы.хсд по активности ссстазляет 65- 75% от исходной.

Пример 4. 50 г сополимера -малеинового ангидрида и акриловой кислоты растворяют в 50 мл смеси ацетона и диметилформамида (1:1) прн ПОСТОЯННОМ леремешивамии и добавляют 1,9,1 г 4,4-диаминод.ифенилоксида, растворенного в 10 мл диметилформамида, вливают при лостояниОМ (Перемешивании в 2000 мл нолиэтилоилоксановой жидкости (типа ПЭС-5). Образовавшуюся эмульсию нагревают.на масляной .бане .з течение 4 чассз при 66° С. Полученные гранулы отфильтровывают, промывают 400 мл эфира, 400 мл ацетона и снова 400 мл эфира и затем высушивают в вакууме при 120°С. Выход составил 50 г сферических гранул диаметром 0,,4 мм.

К 50 г полученного гранулированного сополимера (Малеинового ангидрида и акриловой кислоты добавляют 400 мл ультраконцентрата глюкоамилазы и выдерживают в течение одних суток .при постоянном перемешивании и комнатной температуре. Затем препарат иммобилизованной глюкоамилазы отфильтровывают и тщательно промывают дистиллированной водой до отрицательной реакции на белок. Полученный .препарат высушивают в вакууме лри комнатной температуре. Глюкоа.милазная активность полученного препарата составляет 4400-4600 едг сополимера. Выход по активности составляет около 32% от .исходной.

Пример 5. 50 г сополимера малеинового ан-пидрида .и метакри,ловой кислоты растворяют в 50 мл ацетона при постоянном /перемешивании и добавляют 1,9:1 г 4,4-1ДиаМинодифенилоксида, растворенного в 10 мл диметилформамида. Раствор сополимера при перемешивании вливают В 2000 мл полиэтилсилоксановой жидкости. Образовавшуюся эмульсию при пере.мешивании нагревают пр,и 56° С в течение 5 ча,сов. Полученные гранулы отфильтровывают и тщательно промывают 500 мл ацетона и 500 мл эфира и высушивают в вакууме .при 120° С. Выход составл,яет 50 г сферических гранул диаметром около 0,3- 0,6 мм.

К 50 г полученного сополиме|ра малеино1ВОГО ангидрида и метакриловой кислоты добавляют 400 мл ультраконцентрата глюкоамнлазы. Смесь выдерживают при комнатной температуре и перемешивании в течение суток. Препарат глюкоамила,зы отфильтровывают и тщательно промывают дистиллирова.нной водой до отсутствия реакцЕи «а белок. Полученный препарат .высушивают в .вакууме при комнатной темнератур.е. Глюкоамилазная актив.ность полученного ирепарат.а составляет 4800 едг со:п.олимера. Выход по активности составляет 56% от исходной.

Пример 6. 50 г сополимера малеинового ангидрида и акриламида растворяют в 400 мл ацетона и д(бавляют 50 мл диметилформамида. В реакционную смесь при постоЯННОМ перемешивании вливают раствор 4,4диаминодифенилоксида в диметилформамиде - 1,92 г в 10 мл и выдерживают при тем.пературе 56° С в течение 40 м.ин. К реакционной смеси добавляют 2000 мл нолиэтилсилоксановой жидкости. Образовавшуюся эмульсию при постоянном перемешивании выдерживают в течение 40 мин при 56° С. Полученные гранулы отфильтровывают ,и тщательно промывают серным эфиром (500 мл) и ацетоном (500 мл). Затем гра.нулы .сущат в .Пистолете Фищера над пятиокисью фосфора.

К 50 г полученного гранулированного сополимера мал.еинового ангидрида и акриламида добавляют 800 мл ультраконцентрата

глюкоамила,зы. Реакционную смесь ,выдерживают в течение суток нри постоянном перемешивании и комнатной температуре. Препарат иммобилизованной глюкоамилазы отфильтровывают и тщательно промывают водой до

нейтральной реакции на белок. Препарат высущивают в вакууме при комнатной темнературе. Глюкоа.милазная активность полученного ,препарата составляет 3500-3700 ед/г сополимера. Выход по актив.ности составляет

около 60% от исходной.

Пример 7. 50 г сополимера малеинового ангидрида и N-винилпИридина растворяют в 50 мл диметилформамида при постоянном перемешивании и добавляют 1,91 г 4,4-аиаминодифенилоксида, растворенного в 10 мл диметилформамида. Раствор сополимера вливают при интенсивно.м перемешивании в 2000 мл полиэтилсилоксановой жидкости. Эмульсию при интенсивном перемешивании

выдерживают в течение 3 ч.асов при температуре 80° С. Гранулы сшитого сополимера отфильтровывают и промывают 500 мл серного эфира и 500 мл ацетона. Затем полученные сферические гранулы высушивают в вакууме

при 120° С.

К 50 г полученного гранулированного сополимера малеинового ангидрида и N-винилпиридина добавляют 600 мл ультраконценТрата глюкоамилазы и реакционную Смесь выдерживают в течение суток при постоянном перемешивании и .комнатной температуре. .Препарат иммобилизован.ной глюкоамилазы отфильтровывают и пролтывают в,одой

до отрицательной реакции на белок. Пр&па,р.ат высушивают в вакууме при комнатной температур.е. Глю коами:л.азная активность полученно.го препарата составляет 3300 ед/г сополимера. Вы.ход по активности

составляет около 50% от исходной.

|П p и м e p 8. 46 г сополимера малеинового ангидрида и N-винилпирролидона растворяют в 50 мл диметилформамида и к раствору до1бавляют 4,36 г этилового эфира лизина и 7,18 г уксуснокислого натрия, растворенных в 6 мл диметилформамида. Однородную массу при интенсивно.м перемешивании приливают к 1000 мл полйэтилсилоксалОВой жидкости и Нагревают при температуре 75° С в течение 2 часов. Полученный сшитый сополимер отфильтровывают, промывают 500 мл ацетона, 500 мл этанола и 500 мл эфира. Полученный препарат высушивают в вакууме при 120° С.

iK 50 г сополимера малеинового ангидрида и Ы-винилиирроЛИдона, сшитого лизином, прил.ивают 800 мл ультраконцентрата глюкоамилазы и выдерживают при комщатной температуре в течение суток. Полученный препарат глюкоамилазы отфильтровывают и промывают водой до нейтральной реакции на белок, а затем высушивают в вакууме при комнатной температуре. Глюкоамилазная активность полученного препарата глюкоамилазы составляет 6000-6100 ед/г сополимера. Выход по активности составляет от исходной.

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы путем конденсации фермента с полимерной матрицей, отличающийся тем, что, с целью (повышения активности препаратов, в качестве полимерной матрицы используют сополимеры малеинового ангидрида с гидрофильными сомономерами в сшитом виде.

2.Cnocoi6 по п. 1, о т л и ч а ю ш,и йс я тем,., что в качестве гидрофильного сомономера используют N-винилпирролидон.

3.Способ по п. 1, о т л и ч а ю ш; и йс я тем,. что в качестве гидрофильного сомономер-а используют акриловую кислоту.

4.Способ по п. 1, о т л и ч а ю ш. и и с я тем, что в качестве гидрофильного сомономера используют метакриловую .кислоту.

б. Способ поп. 1, о т л и ч а ю ш, и и с я тем,, что в качестве гидрофильного сомономера используют ак,рилам;ид.

6.Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем,. НТО в качестве гидрофильного сомоиомера используют N-винилпиридин.

7.Способ по пп. 1-.6, отличаюш,ИЙся тем, что в качестве сшивающего агента используют 4,4-диаминодифенилоксид.

8.Способ по пп. 1-6, отличающийся: тем, что в качестве сшивающего агента используют этиловый эфир лизина.

9.Способ по пп. 7 и 8 о т л и ч а ю щ и и с я тем, что сшивающие агенты используют в концентрации 2-10 мол. %.

10. Способ но пп. 1-б, отличающийся: тем, что используют сополимеры, структурированные в виде гранул или в виде армированной пленки.

Источиики информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Березин И. Н., Антонов В. К., Мартинек К. Иммобилизованные ферменты. М., изд.. МГУ, 1976, т. 2, с. 121, 282.

2. D. М. Kramer et al., I. Polymer Sci, Symposium, 1974, № 47, c. 77-87, 89-94.