Способ получения иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью Советский патент 1991 года по МПК C12N11/00 C12N11/04 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам иммобилизации микробных клеток, обладающих глюкозои- зомеразной активностью, может быть использовано в пищевой промышленности при производстве глюкозофруктозного сиропа.

Цель изобретения - повышение ферментативной активности и стабильности целевого продукта.

Способ предусматривает включение клеток Streptomyces albogriseolls 28-3 в носитель, приготовленный из хитозана и ацетата кобальта. Клетки предварительно суспендируют в растворе ацетата магния. Суспендирование клеток позволяет получить биокатализатор с однородным распределением активности, а использование 0,1% ацетата магния стабилизирует1 целевой продукт. Суспензию клеток смешивают

с хитозаном, растворенным в водном растворе ацетата кобальта, а затем полученную смесь закапывают в 8%-ный водный раствор аммиака для образования гранул целевого продукта. Гранулы отделяют и промывают водой. Конечные концентрации компонентов устанавливают следующими, мас.%:

Биомасса клеток по сухой массе3-10

Хитозан1-4

Ацетат кобальта7-15 .

ВодаОстальное

Хитозан, являющийся гелеобраэующим полисахаридом, оказывает стабилизирующее влияние на фермент. Хитозан растворим в кислых средах, поэтому возможно его использование в водном растворе ацетата кобальта, имеющего кислое значение рН.

О

со

Јь v|

СЛ

Применение способа позволяет увеличить активность целевого продукта (от 133 до 135,2-175 ед./г) и его стабильность (от 42 до 46-55 сут).

Способ иллюстрируется следующими примерами,

Пример 1.9г влажных клеток (влажность 90%) Streptomyces albogrlseolls 28-3, полученных после центрифугирования культуральной жидкости и обладающих активностью 48,2 ел/г, суспендируют в 10мл 0,1%-ного раствора ацетата магния и смешивают с 20 мл раствора 1,5 мас.% хитозана в 13,5 мас.% водном ацетате кобальта (рН 4,0-4,5), конечные концентрации компонентов в полученном объеме смеси (30 мл) мас.%: биомасса (по сухой массе - с.м.) 3, ацетата кобальта 9, хитозана 1 (полученную смесь закапывают в 8%-ный раствор водного аммиака (рН 11,0-11,2). Образующиеся гранулы отделяют, промывают водой и фосфатным буфером рН 7,0.

Активность влажного иммобилизованного препарата 135,2 ед./r, стабильность 46 сут.

За единицу активности глюкозоизо- меразы принимают количество фермента, катализирующее изомеризацию 1 мкммоль глюкозы во фруктозу при рН 7,0 и температуре 60°С за 1 мин. В качестве субстрата используют 2М раствор глюкозы с добавлением 10 М ионов магния.

Стабильность иммобилизованного препарата определяют как время полуинактивации глюкозоизомеразы при 60°С и рН 7,0.

Глюкозоизомеразная активность контрольного препарата, полученного по известному способу, составляет 133,7 ед./г влажного препарата и принята за 100%, а стабильность 42 сут.

Пример 2. Иммобилизацию клеток проводят аналогично примеру 1. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас.%: биомасса (по с.м.) 10, ацетат кобальта 8, хитозан 2,5. Активность влажного иммобилизованного препарата 137,1 ед./г, стабильность 46 сут.

Пример 3. Иммобилизацию клеток проводят аналогично примеру 1. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас.%: биомасса (по с.м.) 2, ацетат кобальта 10, хитоэанЗ,5. Активность влажного иммобилизованного препарата 81,2 ед./г, стабильность 13 сут.

Пример 4. Иммобилизацию клеток проводят аналогично примеру 1. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, %: биомасса (по с.м.) 11, ацетат кобальта 10, хитозан 2,5%. Активность влажного иммобилизованного препарата 190,1 ед./г, стабильность 25 сут,

Пример 5. Иммобилизацию клеток проводят аналогично примеру 1. Конечные

концентрации компонентов биокатализатора, мас.%: биомасса (по с.м.) 7, ацетат кобальта 15, хитозан 2. Активность влажного иммобилизованного препарата 174,9 ед./г, стабильность 55 сут.

0 Пример 6. Иммобилизацию клеток проводят аналогично примеру 1. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мае,%: биомасса (по с.м.) 5, ацетат кобальта 7, хитозан 1,5%. Активность

5 влажного иммобилизованного препарата 168,8 ед./г, стабильность 48 сут.

Пример 7. Иммобилизацию клеток проводят аналогично примеру 1, Конечные концентрации компонентов биокатализато0 ра, мас.%: биомасса (по с.м.) 5, ацетат кобальта 6, хитозан 1. Активность влажного иммобилизованного препарата 118,3 ед./г, стабильность 42 сут.

Пример 8. Иммобилизацию клеток

5 проводят аналогично примеру 1. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас.%: биомасса (по с.м,) 7, ацетат кобальта 16, хитозан 1%. Активность влажного иммобилизованного препарата

0 142,8 ед./г, стабильность 37 сут.

Пример 9. Иммобилизацию клеток проводят аналогично примеру 1. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас.%: биомасса (по с.м.) 8, ацетат ко5 бальта 10, хитозан 1,5. Активность влажного иммобилизованного препарата 140,2 ед./г, стабильность 47 сут.

Пример 10. Иммобилизацию клеток проводят аналогично примеру 1. Конечные

0 концентрации компонентов биокатализатора, мас.%: биомасса (по с.м.) 9, ацетат кобальта 7, хитозан 4. Активность влажного иммобилизованного препарата 150,2 ед./г, стабильность - 51 сут.

5Пример. Иммобилизацию клеток

проводят аналогично примеру 1. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас.%: биомасса (по с.м.) 10, ацетат кобальта 8, хитозан 4,5%. Активность

0 влажного иммобилизованного препарата

130.3ед./г, стабильность 40 сут. Пример 12. Иммобилизацию клеток

проводят аналогично примеру 1. Конечные концентрации компонентов биокатализато- 5 ра, мас.%: биомасса (по с.м.) 7%, ацетат кобальта 10%, хитозан 0,5%. Активность влажного иммобилизованного препарата

188.4ед./г, стабильность 21 сут. Пример 13. Иммобилизацию клеток

проводят аналогично примеру 1, но вместо

0,1 %-ного раствора ацетата магния используют дистиллированную воду. Конечные концентрации компонентов биокатализатора; мас.%: биомасса (по с.в.) 8, ацетат кобальта 14, хитозан 3. Активность влажного иммобилизованного препарата 131,8 ед./г, стабильность 29 сут.

Пример 14. Иммобилизацию проводят аналогично примеру 1, только вместо 0,1 %-ного раствора используют 0,05%-ный раствор ацетата магния. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас.%: биомассы (по с.в.) 8, ацетат кобальта 14,хитозан 3.

Активность влажного иммобилизован- ного препарата 143 ед./г, стабильность 34 сут.

Пример 15. Иммобилизацию проводят аналогично примеру 1, но вместо 0,1 %- ного раствора используют 0,5%-ный раствор ацетата магния. Конечные концентрации компонентов биокатализатора, мас.%: биомасса (по с.в.) 5, ацетат кобальта 14, хитозан 3. Активность влажного иммобилизованного препарата 140 ед./г, стабиль- ность 32 сут.

Из приведенных примеров видно, что положительный эффект ацетата магния, заключается в увеличении стабильности препарата.

Сравнительные результаты известного и предлагаемого способов представлены в таблице.

Выбор водного раствора аммиака в качестве осадителя, а также выбор его концен- трации (8%) обусловлен тем, что именно в растворе аммиака такой концентрации происходит формование гранул с образованием гидратированной окиси кобальта необходимой механической прочности.

Снижение концентрации аммиака ведет к снижению механической прочности

образующихся гранул и к удлинению процесса их формования.

Увеличение концентрации амиака также приводит к снижению механической прочности из-за чрезмерно быстрого формирования геля.

Другие осадители (щелочи) не дают гранул необходимой прочности.

Таким образом, предлагаемый L чособ по сравнению с известным позволяет повысить активность иммобилизованного препарата на 26-30% (от 133 до 135,2-175 ед/г), стабильность на 14-30% (с 42 до 44-55 сут), а также получить целевой продукт в гранулированном виде. Предлагаемый способ прост в осуществлении, дешевый, не требует применения сложного дорогостоящего оборудования.

Формула изобретения Способ получения иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, заключающийся во включении клеток Streptomyces albogriseolis 28-3 в нерастворимый носитель на основе ацетата кобальта, отличающийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности и стабильности целевого продукта, клетки предварительно суспендируют в растворе ацетата магния, затем суспензию смешивают с хитозаном, растворенным в водном растворе ацетата кобальта, и проводят гранулирование геля введением полученной смеси в 8%-ный водный раствор аммиака, при этом конечные концентрации компонентов в препарате составляют, мас.%:

Биомасса клеток по сухой массе3-10

Ацетат кобальта7-15

Хитозан1-4

ВодаОстальное

Изобретение относится к биотехнологии и м.б. использовано в пищевой промышленности при производстве глюкозофрукто- вого сиропа. Целью изобретения является повышение ферментативной активности и стабильности целевого продукта. Способ состоит в том, что проводят включение клеток Streptomyces albogrtseolis28-3 в нерастворимый носитель путем смешивания суспензии клеток в ацетате магния с водным раствором хитозана в соли кобальта с последующим осаждением водным аммиаком и отделением образовавшихся гранул биокатализатора. Изобретение позволяет увеличить активность препарата от 133 до 135,2-175 ед/г и повысить его стабильность от 42 до 46-55 дней. Кроме того, полученный препарат обладает удобной для технологического производства гранулированной формой. 1 табл.